Summary
يصف هذا البروتوكول إجراءات تجريبية لتقييم تمايز الخلايا الجذعية بلازماوية في التصحيح باير الأسلاف من الخلايا الجذعية المشتركة، وذلك باستخدام التقنيات التي تنطوي على نظام مراقبة الأصول الميدانية بوساطة العزلة الخلية، ونقل الجينات الهيدروديناميكية، وتحليل تدفق مجموعات فرعية المناعة في التصحيح باير.
Abstract
هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لتحليل قدرة الأسلاف المكونة للدم النقي لتوليد الخلايا الجذعية بلازماوية (PDC) في الأمعاء التصحيح باير (PP). وتنقيته من نخاع العظام من الفئران C57BL6 بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية ونقلها إلى المتلقي الفئران التي تفتقر إلى السكان PDC كبيرة في PP - الأسلاف المشتركة الخلايا الجذعية (ج طقم لو CD115 + + FLT3 CDPs، لين)، وفي هذه الحالة، Ifnar - / - استخدمت الفئران كما المتلقين نقل. في بعض الفئران، وقد تم فرض overexpression من وعامل نمو الخلايا الجذعية FLT3 يجند (Flt3L) قبل بالتبني نقل CDPs، وذلك باستخدام نقل الجينات الهيدروديناميكية (HGT) من Flt3L ترميز البلازميد. Flt3L من overexpression يوسع سكان العاصمة مصدرها نقل (أو الذاتية) الأسلاف المكونة للدم. في 7-10 أيام بعد نقل السلف، تميزوا pDCs التي تنشأ عن الأسلاف نقل adoptively من خلايا المتلقي علىأساس CD45 علامة التعبير، مع pDCs من CDPs نقل يجري CD45.1 + والمتلقين يجري CD45.2 +. تم تقييم قدرة CDPs نقلها إلى المساهمة في السكان PDC في PP والرد على Flt3L بواسطة التدفق الخلوي من PP تعليق خلية واحدة من الفئران المتلقية. هذه الطريقة يمكن استخدامها لاختبار ما إذا كان السكان السلف الأخرى قادرة على توليد PP pDCs. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النهج لدراسة دور العوامل التي من المتوقع أن تؤثر على التنمية PDC في PP، عن طريق نقل مجموعات فرعية السلف مع ضربة قاضية، أو خروج المغلوب من overexpression المناسبة للعامل التنموية المفترضة و / أو عن طريق التلاعب السيتوكينات المتداولة عبر HGT . هذه الطريقة قد تسمح أيضا تحليل الكيفية التي تؤثر pDCs PP تردد أو وظيفة فرعية المناعية الأخرى في ذكر المكتب الصحفى. ومن المزايا الفريدة لهذا الأسلوب هو استخدام Ifnar - / - الفئران، والتي تظهر استنزاف شديد PP pDCs نسبة إلى نوع الحيوانات البرية، وبالتالي allowiنانوغرام إعادة تشكيل PP pDCs في غياب آثار الخلط من أشعة قاتلة.
Introduction
هنا، علينا أن نظهر بروتوكول لتقييم ما إذا كانت الخلايا الجذعية الأسلاف المشتركة (CDPs) قادرة على التسبب في الخلية الجذعية بلازماوية (PDC) السكان في التصحيح باير (PP). وكان الهدف العام من استخدام هذا الأسلوب لتقييم التنظيم التنموية للpDCs في التصحيح باير (PP pDCs). وسبب هذا هو المهم هو أن pDCs PP تختلف عن pDCs وجدت في الأنسجة الأخرى، بما في ذلك نخاع العظام والدم والطحال، وبالتالي فإنه من غير الواضح ما إذا كان pDCs PP والسكان PDC الأخرى تنمويا و / أو ذات الصلة وظيفيا. على وجه التحديد، ومن المعروف على نطاق واسع pDCs لكونها نوع الرئيسي أنا إنترفيرون (الإنترفيرون) المنتجين داخل منظومة المكونة للدم، والاستجابة لتول مثل مستقبلات 7 و 9 (TLR7 / 9) عن طريق تحفيز إفراز الإنترفيرون السريع 1-3. ومع ذلك، pDCs PP تعاني من نقص في إنتاج النوع الأول الإنترفيرون ردا على TLR التحفيز ناهض 4،5. علاوة على ذلك، PP pDCs أيضا تختلف عن pDCs وجدت في نخاع العظام والطحال فيتتطلب إشارات من نوع I إنترفيرون (الإنترفيرون) مستقبلات (IFNAR1) أو الإنترفيرون يشير STAT1 جزيء لتنميتها و / أو تراكم 5. وقد اقترح هذه البيانات إمكانية أن آليات تنظيمية واضحة تحكم pDCs PP مقابل pDCs في الأجهزة الأخرى (مثل نخاع العظم والطحال) 5.
واستند الأساس المنطقي الذي أدى إلى تطوير هذا الأسلوب على التطورات الحديثة في فهم الخلايا الجذعية (DC) علم الأحياء. معظم، إن لم يكن كلها، DC مجموعات فرعية مستمدة من الأسلاف المكونة للدم التي تعبر عن FMS مثل التيروزين كيناز 3 مستقبلات (FLT3) 6-10، ولكن لا يقتصر DC التنمية إلى النخاعي الكلاسيكية والممرات اللمفاوية. على سبيل المثال، FLT3 + الأسلاف النخاعي المشتركة (CMPS، لين - IL-7R - هيئة السلع التموينية-1 - ج + CD34 + عدة FcγR الصغرى / -) تؤدي إلى CDPs (لين - ج طقم لو CD115 + + FLT3)، whicح تمييز الى مزيد من pDCs والبلدان النامية التقليدية (CDCS) 9،10. على النقيض من ذلك، FLT3 + الأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPS، لين - IL-7R + هيئة السلع التموينية-1 لو ج طقم الصغرى) في المقام الأول إلى تطوير pDCs 11. لذلك، تشير دراسات سابقة تنشأ من pDCs لا يقل عن 2 متميزة السكان الاصلية المكونة للدم تحت تنظيم Flt3L، على الرغم من أن تحليل نموذجي وقد يقتصر على نخاع العظم والطحال و / أو مجموعات فرعية PDC الدم. وبالتالي، فإن عدد سكان السلف (ق) التي يولد PP pDCs المطلوب التحقيق. وفهم أصول PP pDCs تسليط الضوء على ما إذا كانت مشاركة مسارات تنموية مشتركة مع السكان PDC أخرى، أو استخدام آليات متميزة خلال جيلهم في مؤتمر المندوبين المفوضين.
وهناك ميزة فريدة من النهج الموصوفة هنا هو استخدام الفئران التي تظهر نقص حاد في PP pDCs كمتلقين لنقل بالتبني من الأسلاف المكونة للدم. الفئران مع الجيناتحذف التشنج في ترميز الجين IFNAR1 (Ifnar - / - الفئران) أو STAT1 (STAT1 - / -) كشفت عن وجود استنزاف لافتة في PP pDCs 5. لذلك، توفر هذه السلالات بيئة التي يتم فيها تخفيض pDCs PP، مما يتيح نقل بالتبني الدراسات التي يتعين القيام بها في غياب الأنظمة الاجتثاث خلية قوية مثل أشعة قاتلة. وقوة إضافية من الطريقة المعروضة هنا هو استخدام نقل الجينات الهيدروديناميكية (HGT) لتحفيز كميات مرتفعة من تعميم Flt3L. هذا يوفر نهجا فعالة من حيث التكلفة للحث على Flt3L في الجسم الحي، مقابل حقن البروتين المؤتلف. وقد استخدمت العديد من الدراسات، بما في ذلك تلك الموجودة في مختبرنا، HGT للحث على كميات خلوى في مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية 5،12،13.
تقسيم العمل وظائف المناعة دقيقة بالنسبة للبلدان النامية هو من مصلحة كبرى في علم المناعة. على وجه الخصوص، pDCs وسطاء المهم التسامح عن طريق الفم والنظامية المضادة للفيروساتالاستجابات، ولكنها تظهر أيضا على المساهمة في التنمية واستمرار المناعة الذاتية والسرطان 14-17. سوف بروتوكول الموصوفة هنا تسمح الآليات التنموية التي تنظم PP pDCs أن يكون استكشاف أكثر اكتمالا. بالإضافة إلى ذلك، قد يسمح هذا النهج من الدراسات لتقييم وظيفة PP PDC، ويجوز تمديدها لفهم التنظيم وظيفة من السكان المناعية الأخرى داخل ذكر المكتب الصحفى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب الحصول على موافقة المؤسسية مقدما للجميع التلاعب التجريبية الموصوفة هنا تنطوي على الفئران. وتشمل هذه استخدام الفئران C57BL6 لعزل الخلايا الاصلية نخاع العظام، Ifnar - / - الفئران كمتلقين لنقل بالتبني من الأسلاف المكونة للدم واستخدام HGT لمن overexpression خلوى في الجسم الحي. كما يجب توفير السكن المناسب والرعاية الحيوانية من قبل المحقق أو مؤسسة. وعلاوة على ذلك، قد تكون هناك حاجة لموافقة المؤسسية البلازميدات المستخدمة في نقل الجينات الهيدروديناميكية (أي الموافقة الحمض النووي المؤتلف). تمت الموافقة على الدراسات وصفها هنا من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام UT في مركز اندرسون للسرطان.
1. الهيدروديناميكية نقل الجينات (HGT)
يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة 2 أيام قبل نقل بالتبني من CDPs للحث على تعميم Flt3L للتوسع في الجسم الحي DC 5. العلاقات العامةepare لا يقل عن 5 المستفيدة الفئران / المجموعة.
- لتحقيق كفاءة HGT، والأوعية الدموية للمتلقي Ifnar - يجب أن تكون متسعة الفئران (CD45.2 +) من خلال تعريض الفئران لمصباح التدفئة لمدة 5-10 دقيقة - /.
- ضع الماوس في جهاز كابح وتطهير ذيله مع الايثانول 70٪.
- ضخ 5 ميكروغرام من ترميز البلازميد Flt3L في 2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة في الذيل الوريد باستخدام إبرة G 27. لأتراب السيطرة، وضخ 5 ميكروغرام من ناقلات الفارغة (pORF) عن طريق الوريد الذيل كما هو مبين.
- مراقبة الفئران ل15-30 دقيقة لضمان عدم وجود آثار ضارة للحقن الوريد الذيل. العودة الفئران لمنشأة سكنية لمدة 2 ايام.
2. عزل أسلاف المكونة للدم من نخاع العظم ماوس
يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد أيام 2 HGT. استخدام CD45.1 + الفئران مسانج كمصدر من الأسلاف نخاع العظم لنقل بالتبني في المتلقي Ifnar - /- الحيوانات (CD45.2 +). في هذا البروتوكول، يتعين على السلالات مسانج للتمييز المانحة والبلدان النامية المستمدة من المتلقي، وكذلك لتجنب استنزاف مناعية بسبب عدم تطابق MHC. وسوف تكون هناك حاجة حوالي 10-20 الفئران لتوفير أعداد كافية من الخلايا الاصلية المكونة للدم (10 5 خلية / الماوس المتلقي) لنقل التجارب.
- الموت ببطء 10 مسانج CD45.1 + الفئران عن طريق CO 2 الخنق وخلع عنق الرحم.
- وضع كل جثة على صينية تشريح وتعقيم البطن والساقين مع الايثانول 70٪.
- إجراء شق في منتصف البطن وقطع طريق الجلد من البطن إلى كل ساق، وقطع الجلد أسفل طول الساق.
- بلطف إزالة الجلد من كل ساق، وقطع وإزالة الساقين من الذبيحة في مفصل الورك باستخدام مقص حاد.
- إزالة بعناية العضلات من الفخذ والساق من كل ساق باستخدام شفرة حادة.
- نزعكلا طرفي عظم الفخذ والساق مع مشرط حاد ووضع العظام في صحن الثقافة التي تحتوي على RPMI كاملة (RMPI مع 10٪ مصل للحرارة المعطل الجنين البقري، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 50 ميكرومتر β-المركابتويثانول) .
- تحضير حقنة تحتوي على 1 مل من RPMI كاملة، متصلة G 27 إبرة.
- إدراج إبرة 27 G في واحدة من نهاية عظم الفخذ أو الساق. طرد نخاع العظم من عظم الفخذ أو الساق عن طريق حقن بلطف RPMI كاملة في العظام. ضمان أن يتم إزالة خلايا نخاع العظام من العظام، وهذا يمكن أن يتحقق عن طريق الكشف عن البصر وسائل الإعلام التي تظهر طرد غائم.
- تكرار التنظيف كل عظم الفخذ والظنبوب 3X لإزالة خلايا نخاع العظم بدقة.
- إعداد تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting بلطف خلايا صعودا وهبوطا 3-5X في صحن الثقافة.
- إزالة الأنقاض وذلك بتمرير خلايا نخاع العظام من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر، ووضع الخلايا ناضح في الثقافة الجديدةطبق ه. تعطيل أي كتل الخلايا التي تظهر على مصفاة بواسطة ضغط لطيف مع نهاية حقنة المكبس معقمة.
- ليز خلايا الدم الحمراء (RBC) موجودة في تعليق خلية نخاع العظم مع مجموعه التجارية RBC العازلة تحلل فقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام 2 مل تحلل RBC buffer/4-6 × 10 7 خلايا (عادة خلايا من الفأر واحدة)، وفترة حضانة لمدة 5 دقائق على RT.
- غسل خلايا نخاع العظام بواسطة التكوير الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 500 x ج، الشفط بلطف مستنبت، إعادة التعليق في 10 مل FACS العازلة (برنامج تلفزيوني 1X + 2 ملي EDTA + 1٪ FBS)، والخلايا بواسطة الطرد المركزي والتكوير بلطف غسل الشفط العازلة.
- تكرار الغسيل، كما هو موضح في الخطوة 2.13، أي ما مجموعه 2 يغسل.
3. مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) لعزل CDPs
هذه الخطوة يتطلب الوصول إلى فاصل الخلايا MidiMACS والأعمدة MACS دينار لإجراء اختيار السلبية الأولية،فضلا عن نظام مراقبة الأصول الميدانية مع آلة لا يقل عن 3 ليزر لتنقية السلف فرعية متعدد الألوان بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة مترافق fluorescently.
- بعد غسل الثاني في الخطوة 2.14، عد خلايا نخاع العظام. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 2.13 و resuspend العازلة في نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحقيق تركيز النهائي من 4 × 10 7 خلية لكل ميكرولتر من العازلة 30 نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- لإعداد الخلايا لنظام مراقبة الأصول الميدانية، يتم إثراء خلايا النسب السلبية الاولى لاختيار الأسلوب السلبي الذي يزيل الخلايا النسب إيجابية من خليط نخاع العظام باستخدام حبة المغناطيسي العمود اللوني. لإجراءات الاختيار السلبي، إضافة 1 ميكروغرام لكل من الأجسام المضادة التالية الفئران التجارية مكافحة فأر (عبس) التي تعترف علامات النسب المكونة للدم: CD3، CD19، CD11c و، CD11b، وتير 119 عبس. ينبغي إضافة عبس في حجم 2 ميكرولتر / أب لتعليق الخلية 30 ميكرولتر العازلة في نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- احتضان تعليق الخلية في 4 درجة مئوية لمدة 30دقيقة. بعد الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع 10 مل من العازلة FACS كما هو موضح في الخطوة 2.13.
- الخلايا resuspend لتحقيق تركيز النهائي من 4 × 10 7 cells/40 ميكرولتر من العازلة FACS. إضافة 20 ميكرولتر من الماعز لمكافحة الفئران بلي المغناطيسي مفتش لكل 40 ميكرولتر من التعليق الخلية. المزيج بلطف واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مع 10 مل من العازلة FACS كما هو موضح في الخطوة 2.13.
- في resuspend تصل إلى 10 خلايا نخاع العظام في 8 500 ميكرولتر من العازلة FACS.
- تحميل العمود MACS LD على فاصل الخلايا MidiMACS فقا لتعليمات الشركة الصانعة وprerinse العمود مع 2 مل FACS العازلة.
- تطبيق تعليق خلية نخاع العظم إلى العمود، وتحميل ما يصل إلى 5 × 10 8 خلايا في 2.5 مل من العازلة FACS. ضمان أنبوب جمع (15 مل المخروطية أنبوب) يتم وضعها تحت العمود. غسل العمود 3X مع 2 مل من العازلة FACS / غسل، وجمع الخلايا التي تمر من خلال العمود، والتي سيتم المخصب لخلايا النسب السلبية. عد الخلايا في المواد مزال (يغسل من خلال) من العمود.
- اختيار لأداء الإيجابي للمجموعات فرعية السلف المكونة للدم عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية، وخلايا وصمة عار مع عبس مترافق fluorescently التالية: IL-7R (الأزرق المحيط الهادئ)، FLT3 (PE)، هيئة السلع التموينية-1 (PE.Cy7)، CD115 (APC)، ج طقم (APC.Cy7) عبس، بالإضافة إلى خليط من عبس علامة النسب الموجهة ضد CD3، CD19، CD11c و، CD11b، F4/80 وTer119 (المسمى مع جميع PerCP Cy5.5). استخدام 0.5-1 ميكرولتر من كل أب في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. احتضان تعليق خلية في 4 درجات مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
- غسل الخلايا كما هو مبين في الخطوة 2.13 و resuspend العازلة FACS بتركيز 2-3 × 10 7 خلية / مل. تحديد الخلايا من خلال أنبوب 35 ميكرومتر غطاء مصفاة الخلية لإزالة كتل الخلية. هذه الخطوة الأخيرة هي الحاسمة لتجنب انسداد الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- ضع تعليق الخلية في أنبوب FACS على الساحة نظام مراقبة الأصول الميدانية وفرز CDPs (لين - ج طقم لو CD115 + + FLT3) علىأساس بيان علامة المشار إليه. جمع الخلايا النقية في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من RPMI كاملة.
- تسجيل العدد المطلق للخلايا فرزها في نهاية المدى نظام مراقبة الأصول الميدانية. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي كما هو مبين في الخطوة 2.13 و resuspend في برنامج تلفزيوني العقيمة للتجارب نقل بالتبني.
4. نقل بالتبني من CDPs
وعادة ما تتم هذه الخطوة في منشأة الحيوان حيث يتم إيواء الفئران المتلقية. اعتمادا على موقع للآلة نظام مراقبة الأصول الميدانية، قد تنطوي على نقل السكان الخلية السلف النقية في منشأة الحيوان قبل نقل بالتبني. يجب أن تبقى الايقاف الخلية السلف معقمة ونقلها على الجليد.
- إعداد تعليق خلية للحقن عن طريق تمييع 10 5 CDPs المنقى في إجمالي حجم 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني العقيمة. وضع تعليق خلية في حقنة تركيبها على 27 إبرة G.
- فضح المتلقي Ifnar - / - +) إلى مصباح التدفئة لمدة 5-10 دقيقة لتحقيق كفاءة الحقن عبر الوريد الذيل.
- ضع الماوس في جهاز كابح وتطهير ذيله مع الايثانول 70٪.
- ضخ 10 5 FACS-تنقيته CDPs في 100 ميكرولتر PBS في الوريد الذيل باستخدام إبرة G 27.
- مراقبة الفئران ل15-30 دقيقة لضمان عدم وجود آثار ضارة للحقن الوريد الذيل. العودة الفئران لمنشأة سكنية.
5. عزل PP وقياس المبالغ PDC
- في 7-10 أيام التالية نقل بالتبني، الموت ببطء الفئران المتلقية. بلطف فتح الماوس عن طريق تشريح وفضح الأمعاء.
- إزالة الأمعاء بأكملها ووضعه على المناشف الورقية PBS غارقة. جمع كل ذكر المكتب الصحفى مرئية على طول جدار الأمعاء الدقيقة باستخدام ملقط غرامة ومقص. لديك الفئران عادة 5-10 PP / الماوس، والتي تختلف من بصيلات اللمفاوية المعزولة وجدت - C57BL6 وIfnar - /على طول الأمعاء الدقيقة 18. نلاحظ أن ذكر المكتب الصحفى غالبا ما تكون متميزة هيكليا حتى داخل ماوس واحدة، وضمان ذلك بعناية ويتم تحديد كل ذكر المكتب الصحفى وتشريح.
- ذكر المكتب الصحفى وضع في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني، واستخدام الملقط لإزالة البراز. كرر هذا الإجراء مرتين لتنظيف ذكر المكتب الصحفى.
- ملخص ذكر المكتب الصحفى مع 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع في 10 مل 1X هانك محلول ملحي متوازن (HBSS) في 50 مل قارورة مع التحريك قوية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- وضع PP هضمها في المقصورة العلوي من 40 ميكرومتر مصفاة الخلية وقوة الخلايا من خلال مصفاة مع حقنة المكبس معقمة. جمع تعليق خلية PP في أنبوب مخروطي 15 مل.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي PP المتوترة في 500 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend في 6 مل من 37٪ Percoll الحل (37٪ Percoll في RPMI متوسطة). وضع بلطف 6 مل من 70٪ Percoll الحل (70٪ Percoll في RPMI متوسطة) تحت تعليق خلية، لتشكيل Percoll الخطوة التدرج.
- خلايا الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة لر 800 x ج مع قطع أجهزة الطرد المركزي. الخلايا وحيدة النواة سوف يهاجر إلى واجهة 37/70٪. بعد الطرد المركزي، ينبغي جمع السكان خلية وحيدات النوى من قبل pipetting الحذر في المنطقة واجهة. بيليه جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي، ويغسل مرتين في 50 مل من RPMI كاملة / غسل. يتم استخدام كمية كبيرة لضمان إزالة كاملة Percoll.
- وصمة عار على الخلايا PP جمعت مع الأجسام المضادة التالية للكشف عن pDCs الفئران التي تستمد من الأسلاف نقل adoptively (CD45.1 +) أو الفئران المتلقية (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7)، CD45.2 (PE . Cy7)، CD11c و(الأزرق المحيط الهادئ)، CD11b (PerCP Cy5.5)، B220 (APC)، Siglec-H (PE) وPDCA-1 (FITC) عبس. أداء تحليل التدفق الخلوي للخلايا PP كما هو مبين في الخطوات 3.9 و 3.10. تحديد pDCs بواسطة CD11c وعلى CD11b + - + B220-H + Siglec PDCA-1 + النمط الظاهري. يمكن تحديد أرقام PDC مطلق عن طريق المعادلة التالية:٪ pDCs العاشر لعدد الخلايا التل PP PP = pDCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائجنا تظهر استراتيجية النابضة لعزل CDPs من الماوس خلايا نخاع العظم (الشكل 1)، على النحو المفصل في البروتوكولات 2 و 3. تشمل CDPs حوالي 0.1٪ من مجموع خلايا نخاع العظام، وحوالي 4-6 × 10 4 CDPs يمكن عزلها عن الماوس واحد. عند نقل بالتبني، CDPs تفرق في pDCs وCDCS 10.
الشكل 1. استراتيجية المحاصرة لنظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية CDPs. تم جمع خلايا نخاع العظام من الفئران C57BL6. تم استنفاد الخلايا إيجابية مع النسب عبس ضد علامات النسب (CD3، CD19، CD11b، CD11c و، Ter119) باستخدام MACS اختيار بوساطة microbead. كانت ملطخة المخصب السكان نخاع العظام النسب السلبية مع fluorescently المسمى-Aإفطار لCDP والنسب علامات، وتنقيته من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية كما هو مبين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
لتحديد pDCs في ذكر المكتب الصحفى، ونحن نستخدم أولية إلى الأمام والجانب استراتيجية النابضة مبعثر، تليها النابضة لCD11c و+ Siglec-H + الخلايا (أرقام 2A و 2B) Ifnar - / - الفئران لديهم انخفاض ملحوظ في pDCs في ذكر المكتب الصحفى النسبية ل النوع البري الفئران (الشكل 2B) 5. على النقيض من ذلك، CD11c و+ Siglec-H - تم العثور على CDCS في كميات مماثلة في كل من التراكيب الوراثية (الشكل 2B). وبالتالي، Ifnar - توفير الفئران فرصة لدراسة إعادة PP PDC دون آثار الإشعاع المميتة 5 - /. على سبيل المثال، نقل بالتبني من النوع البري CDPs في Ifnar - / - الفئران، كما هو موضح في الخطوة 4، يحفز زيادة في PP pDCs (الشكل 2B). علاوة على ذلك، المعالجة مع Flt3L HGT (الخطوة 1) زيادة تعزيز التوسع في ذكر المكتب الصحفى PDC (الشكل 2B)، مما يعني CDPs نقل وإمكانية الذاتية FLT3 + الأسلاف الرد على Flt3L عن طريق حفز pDCs PP. كما حفز كلا الشرطين CD11c و+ Siglec-H - CDCS تبلغ، بما يتفق مع الأصل التنموية للCDCS 6. pDCs في ذكر المكتب الصحفى التعبير عن علامات التقليدية بما في ذلك PDCA PDC-1، Siglec-H وB220، وتفتقر CD11b (أرقام 2B-D) 4،5. بالإضافة إلى ذلك، ذكر المكتب الصحفى تحليل من Ifnar - / - أظهرت الفئران التي حصلت على حد سواء Flt3L HGT ونقل CDPs أن الغالبية (~ 70٪) من pDCs مستمدة من الجهات المانحة (CD45.1 +) الفئران (الشكل 2E). بشكل جماعي، تظهر هذه البيانات أن نقل بالتبني من CDPs يدفع السكان PP PDC في استجابة لإشارات Flt3L بوساطة في الجسم الحي.
المحتويات "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
تم حقن الفئران عن طريق الوريد مع 5 ميكروغرام من البلازميد ترميز Flt3L أو متجه فارغة (pORF) بواسطة HGT - الشكل 2 تحليل PP PDC في Ifnar - / - الفئران على Flt3L HGT ونقل بالتبني من CDPs Ifnar - /. بعد ذلك بيومين، تم نقل 10 5 CDPs-تنقيته FACS adoptively عبر حقن الوريد الذيل. سبعة أيام بعد نقل CDP، وذكر المكتب الصحفى جمعها وتحليلها للمبالغ PDC (A، B). CD11c و+ Siglec-H + pDCs في الفئران التي تلقت CDPs + Flt3L HGT تم تحليل آخر لPDCA-1، B220 (C)، CD11b (D)، وCD45.1 CD45.2 (E) التعبير. كان نمط التعبير عن PDCA-1، B220 وCD11b مماثلة في pDCs في جميع المجموعات 3 (البياناتلا تظهر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية نقل بالتبني وصفها المقررة في هذه الوثيقة مساهمة CDPs للسكان PP PDC في الفئران المتلقية التي تعاني من نقص في PP pDCs (على سبيل المثال Ifnar - / - الفئران). في التجارب في المستقبل، سيكون من المهم لتقييم إمكانات مجموعات فرعية السلف الأخرى في توليد pDCs PP، وبخاصة ما إذا كان pDCs PP مستمدة من FLT3 + CLPS. هذا السؤال مهم لأنه يبقى من غير الواضح لماذا pDCs PP حساسة بشكل فريد لإشارات IFNAR-STAT1 لPP 5 الاستحقاق، وإذا اتبع pDCs PP العظة التنموية مماثلة لpDCs في الأجهزة الأخرى.
من الناحية النظرية، يمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذه الطريقة في الفئران التي تفتقر إلى السكان PDC في جميع الأجهزة. على سبيل المثال، الفئران مع نقص في عامل النسخ E2-2، والحزب الديمقراطي المسيحي "المنظم الرئيسي" (أي Tcf4 - / - الفئران)، وتظهر ضرب PDC استنزاف 19. ومع ذلك، Tcf4 - / - هيئة التصنيع العسكريه هي الجنينية قاتلة، وبالتالي Tcf4 - / - يحتاج نخاع العظم الفئران خيالية لاستخدامها كمتلقين للتجارب نقل بالتبني. ومع ذلك، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كان pDCs PP حساسة للأشعة وسيتم المنضب بشكل فعال في Tcf4 - / - الوهم. علاوة على ذلك، التشعيع قاتلة له آثار واسعة على نظام المكونة للدم ودعم السكان اللحمية التي قد تؤثر PP PDC إعادة. وبالتالي، فإن استخدام Ifnar - / - الفئران كما قد يكون من المفضل المتلقين لتقييم قدرة adoptively مجموعات فرعية السلف نقل لتوليد pDCs PP لTcf4 - / -. الوهم STAT1 - / - الفئران تظهر أيضا انخفاض في ضرب pDCs PP ويمكن استخدامها كمتلقين للدراسات نقل بالتبني ل دراسة PP PDC أصول التنموية 5. والتحذير إلى استخدام Ifnar - / - أو STAT1 - / - الفئران هو حالة العوز المناعي، ومبادرة الخوذ البيضاءالفصل يمكن أن تؤثر PP PDC إعادة أو وظيفة بطرق غير معروف. وبالتالي، فإن النهج المستقل لتقييم أصول التنموية PP PDC تعزيز الثقة في تفسير البيانات.
من الناحية الفنية، تجدر الإشارة إلى أن يتم العثور على السكان CDP على تردد منخفض جدا في المجموع نخاع العظم، وبالتالي استنفاد خلايا علامة إيجابية النسب التي كتبها المغناطيسي بوساطة حبة العمود اللوني قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية مهم لتنقية كفاءة من الخلايا الاصلية من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. هذه الخطوة استنزاف يثري خلايا النسب السلبية، مما أدى إلى انخفاض الوقت نظام مراقبة الأصول الميدانية (والتكاليف) لتنقية السلف. الإجراء المستنفدة الموصوفة هنا يستخدم خليط من الأجسام المضادة النسب المحددة التي تم ضمها لكل تجربة. التجارية الكوكتيلات نسب الأجسام المضادة وتتوفر أيضا، ويمكن استخدامها لإزالة الخلايا النسب الإيجابية، بدلا من الخليط الذي وصفنا. الاستفادة من النهج وصفها هو مرونته في كونها قابلة للتكيف للالمتنوعةأغراض استنزاف خمتلفة، عن طريق ضبط الأجسام المضادة التي تكون موجودة في الخليط.
في إعداد تعليق خلية واحدة من ذكر المكتب الصحفى، فمن المهم لإزالة أكبر قدر من أنسجة الأمعاء المحيطة ذكر المكتب الصحفى ممكن. وهذا يمكن أن يتحقق من خلال تشريح دقيق للذكر المكتب الصحفى. الهضم كافية من ذكر المكتب الصحفى مع كولاجيناز هو خطوة رئيسية لاطلاق سراح الكريات البيض من أنسجة الأمعاء. وPercoll الكثافة التدرج تقنية الطرد المركزي وصفها هو الأسلوب المفضل لتخصيب الكريات البيض من عينات PP هضمها. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن البروتين علامة PDC PDCA-1 يمكن تنظيمها حسب نوع I الإنترفيرون والمحفزات الأخرى 20. لذلك، ويفضل Siglec-H كعلامة PDC للدراسات التي تنطوي على التلاعب خلوى.
استخدام HGT لديها ميزة واضحة من حيث كونها فعالة للغاية من حيث التكلفة. بينما استخدمت Flt3L HGT في هذه الدراسة، والقدرة السيتوكينات الأخرى أو العوامل القابلة للذوبان لريجيمكن اختبار pDCs ulate PP باستخدام HGT، في غياب أو وجود خلية نقل بالتبني من الأسلاف المكونة للدم. ومع ذلك، HGT النتائج في الإنتاج المستدام من السيتوكينات من البلازميد نقل مقابل زيادات أكثر عابرة لوحظ خلال حقن خلوى المؤتلف، والتي تعتمد على خلوى نصف حياة 5،13. قد لا تعكس الارتفاع ممتدة من تعميم خلوى كميات الفسيولوجية التي تحققت خلال المكونة للدم في حالات الطوارئ أو عدوى الردود. يجب أن تبقى هذا التحذير في الاعتبار خلال مراحل التخطيط التجريبية وتقييم البيانات.
في العمل في المستقبل، والتلاعب انتقائية من السكان PP PDC، كما هو موضح هنا، قد يساعد في معالجة ظيفة PP PDC. هي مشروطة pDCs PP وسطاء موجودة في البيئة المخاطية وتعاني من نقص في إنتاج الإنترفيرون النوع الأول على تفعيل TLR 4،5. تحليل pDCs PP المعاد داخل STAT1 - / - أظهرت الفئران هذه مLLS ديهم قدرة منخفضة نسبيا للحث على النوع الأول من الإنترفيرون على TLR9 تسبب نسبة إلى pDCs PP الناشئة بطبيعة الحال (لا يظهر)، مشيرا إلى pDCs PP المستمدة من CDPs نقل تحتفظ على الأقل من هذه الخاصية الطبيعية PP pDCs. نوع خفضت أنا الإنترفيرون إنتاج PP pDCs يتناقض مع نوع قوي أنا الإنترفيرون إفراز السكان PDC الأخرى ويثير سؤالا حول دور وظيفي من PP pDCs. علاوة على ذلك، pDCs PP تشبه pDCs أن تتطور في وجود النوع الأول الإنترفيرون، يبلغ عدد سكانها PDC الذي يوضح التحفيز الفعال للIL-17-إنتاج CD4 + T الليمفاوية (خلايا TH17) 5. في حين أن الخلايا TH17 تعتبر على نطاق واسع أن يكون السكان الذي يحفز التهابات، لديهم أدوار كل من واقية والمسببة للأمراض في الأمعاء 21. بشكل منفصل، تم الإبلاغ عن pDCs للتوسط التسامح النظامية إلى الفم مستضد 15. دور pDCs PP في الحصانة المحلية والنظامية هو من مصلحة كبيرة، كما فهم هذه النقطة قد تكشف عن شمال شرقالنهج ث لمعالجة الاستجابات المناعية والتهابات في الامعاء في العلاج المرض.
في الختام، وطريقة الواردة في هذه الوثيقة يمكن تقييم القدرة التنموية للمجموعات فرعية السلف المكونة للدم لتوليد PP pDCs. يوفر هذا الإجراء الفئران مع pDCs PP المعاد. وبالتالي، يمكن استخدام هذا النهج ليس فقط لتقييم PP PDC أصول المكونة للدم ولكن أيضا لفهم مساهمة pDCs PP إلى وظائف المناعة داخل البيئة المعوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر الدكاترة. اليكس Gelbard ويليم Overwijk لتقديم المشورة بشأن نقل الجينات الهيدروديناميكية. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (AI098099، الرياح)، ومركز إم دي أندرسون للسرطان علم التخلق، ومركز أندرسون MD للالتهاب والسرطان (SSW)، وصندوق RE بوب سميث التعليم (الأعرج).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
