Syntese av en Intein-mediert Kunstig Protein Hydrogel

Summary

Vi presenterer syntesen av en splitt-intein-mediert protein hydrogel. Byggesteinene i denne hydrogel er to protein-kopolymerer som hver inneholder en subenhet av en trimere protein som fungerer som en kryssbinder og en halvdel av en splittet intein. Blanding av de to protein kopolymerer utløser en intein trans-spleising reaksjon, noe som gir et polypeptid enhet som selv setter sammen til en hydrogel. Denne hydrogel er sterkt pH-og temperatur-stabile, er forenelig med organiske løsningsmidler, og lett inkorporerer funksjonelle globulære proteiner.

Abstract

Vi presenterer syntesen av et meget stabilt protein hydrogel mediert av en splitt-intein-katalysert protein trans-skjøting reaksjon. Byggesteinene i denne hydrogel er to protein blokk-kopolymerer som hver inneholder en subenhet av en trimere protein som fungerer som en kryssbinder og en halvdel av en splittet intein. Et sterkt hydrofil tilfeldig spole er innsatt i en av blokk-kopolymerer for vannretensjon. Blanding av de to proteiner blokk-kopolymerer utløser en intein trans-spleising reaksjon, noe som gir et polypeptid med tverrbindingsenhet ved hver ende som raskt selv setter sammen til en hydrogel. Denne hydrogel er meget stabilt under både sure og basiske betingelser, ved temperaturer opp til 50 ° C og i organiske løsemidler. Den hydrogel raskt reformer etter skjær-indusert ruptur. Innlemmelse av en "docking station peptid" inn i hydrogelen byggeblokken muliggjør praktisk inkorporering av "docking protein"-merket målproteiner.Hydrogelen er kompatibel med vevskultur vekstmedier, støtter diffusjonen av 20 kDa-molekyler, og gjør det mulig for immobilisering av bioaktive globulære proteiner. Anvendelsen av intein-mediert protein hydrogel som et organisk-løsningsmiddel-forenlig biokatalysator ble demonstrert ved å innkapsle pepperrot peroksydase enzym og bekreftende dens aktivitet.

Introduction

Hydrogeler laget utelukkende av proteiner bære potensial til å avansere felt så forskjellige som tissue engineering, levering av legemidler og biofabrication ^en. De har fordeler i forhold til tradisjonelle syntetiske polymer hydrogeler inkludert biokompatibilitet og et potensial til invasivt støtte inkorporering av bioaktive globulære proteiner.

I dette arbeidet, vil vi beskrive utviklingen av et nytt protein hydrogel dannet via en splitt-intein-mediert protein trans-skjøting reaksjonen og dens anvendelse som et protein immobilisering stillaset (figur 1). Byggesteinene for denne hydrogel er to protein blokk-kopolymerer hver omfattende den N-eller C-terminale fragment av en splittet intein (IN og IC) og en subenhet av et multimert protein tverrbinder. Den DnaE intein fra Nostoc punctiforme (NPU) ble brukt som split intein ^2,3 og en liten trimere protein (12 kDa) CutA fra Pyrococcus horikoshii </ Em> ble anvendt som tverrbindingsprotein ^4,5. Forskjellige tverrbindere er sluttet gjennom intein katalysert trans-spleising reaksjon, som fører til dannelsen av et sterkt tverrbundet proteinnettverket (hydrogel). NPU intein ble valgt på grunn av sin raske reaksjonskinetikk (t _1/2 = 63 sek) og høy trans-spleising yield (nær 80%) ^2,3. Den CutA protein ble valgt som tverrbindingsmiddel på grunn av sin høye stabilitet. CutA trimerer har en denaturering temperatur på nær 150 ° C og beholde trimere kvaternær struktur i oppløsninger inneholdende så mye som 5 M guanidin-hydroklorid ^4,6. Siden subenheten utveksling mellom ulike crosslinkers er en stor bidragsyter til den fysiske hydrogel overflateerosjon ^7, bør den meget sterke inter subenheten samhandling i CutA fraråde slike subenheten børser, som fører til en mer stabil hydrogel. En av disse byggeklosser inneholder også et sterkt hydrofilt peptid S-fragment som midtblokken for å forenkle vannoppbevaring ^åtte.

Blanding av de to hydrogel byggeklosser initierer en trans-spleising reaksjonen mellom IN og IC intein fragmenter, generering av et lengre polypeptid-kjede med tverrbindingsmidler i begge terminaler. Tverrbindere fra flere slike molekylære enheter kommuniserer med hverandre og danner en meget kryssbundet hydrogel nettverk (figur 1A). En spesifikk "docking station peptid" (DSP) er innlemmet i en av de hydrogel byggeblokker for å lette stabil immobilisering av en "docking protein" (DP)-merket målprotein inn i hydrogelen. Bruk av et delt intein å mediere hydrogel sammenstillingen ikke bare gir ytterligere fleksibilitet for proteinsyntese hydrogel, men også gjør det mulig med høy tetthet, jevn belastning av målproteinet i hele hydrogel, som målproteiner lastes før hydrogel formasjonen.

Den intein-mediert protein hydrogel er svært stagjengelig i vandig oppløsning med liten til ingen påvisbar erosjon etter 3 måneder ved romtemperatur. Stabilitet er beholdt i et bredt spekter av pH-verdier (6-10) og temperaturer (4-50 ° C), og hydrogelen er også kompatibel med organiske løsningsmidler. Denne hydrogel blir brukt for immobilisering av to globulære proteiner: grønt fluorescerende protein (GFP) og pepperrotperoksidase (HRP). Hydrogel omslutte den sistnevnte protein blir brukt til å utføre biocatalysis i et organisk løsningsmiddel.

Protocol

En. Plasmid Construction

MERK: Alle gener ble forsterket under standard PCR reaksjoner ved hjelp Phusion Høy Fidelity DNA Polymerase per produsentens spesifikasjoner. Primere benyttet for kloning er blitt beskrevet tidligere ^9.. Alle konstruksjoner er oppført i Tabell 1.

1. For å generere CutA-NpuN (N, Tabell 1):
   1. PCR forsterke CutA og NpuN gener fra plasmider pET30-CutA-Tip1 ¹⁰ og KanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, henholdsvis, å bruke de riktige primere.
   2. Fordøy disse fragmentene med de passende restriksjonsenzymer, og sekvensmessig setter disse fragmentene inn i pET26b vektoren mellom T7-promoteren og en C-terminal 6xHistidine signal for å generere N (figur 2A).
2. For å generere NpuC-S-CutA (C, Tabell 1):
   1. PCR Forsterke NpuC, CutA og S fragment [AG ₃ (PEG)] ₁₀ fra plasmid KanR-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, pET30-CutA-Tip1 ¹⁰ og pQE9 AC ₁₀ Atrp ^12, henholdsvis, å bruke de riktige primere.
   2. Fordøy disse fragmentene med de passende restriksjonsenzymer, og sekvensmessig setter disse fragmentene inn i pET26b vektoren mellom T7 promoter og en C-terminal 6xHistidine å generere C (figur 2B).
3. For å generere NpuC-S-SH3 _lig-CutA (C-SH3 _LIG, Tabell 1):
   1. PCR Forsterke CutA bruker primere inneholder en SH3 _ly (PPPALPPKRRR) og en fleksibel linker (GGGGS) ₂ for å generere fragment SH3 _ly-CutA.
   2. Sett på CutA genet fra C med fragment SH3 _ly-CutA.
4. For å generere SH3-GFP (Tabell 1):
   1. Forsterke SH3 genet fra plasmid pJD757 ¹³ brukeregnede primere.
   2. Sikring dette fragmentet til GFP genet og sett den inn i pET26b vektor mellom T7 promoter (figur 2C) og en C-terminal 6xHistidine tag.

2. Protein Expression

1. Transformering 50 pl av kjemisk kompetent E. coli BL21 (DE3) med det passende ekspresjonsplasmidet.
2. Etter transformasjon, serielt fortynnet i disse cellene, og plate dem på Luria-Bertani (LB) / agarplater inneholdende 50 ug / ml kanamycin.
3. Inkuber plater inneholdende transformerte celler ved 37 ° C i ~ 15 timer.
4. Etter inkubering, å velge en plate som inneholder 50 til 100 kolonier og resuspender alle koloniene i 5 ml LB-næringsløsning.
5. Overføring suspensjonen til en l LB-næringsløsning inneholdende kanamycin (50 pg / ml) og vokser cellene ved 37 ° C med rysting ved 250 rpm. Overvåke absorbans ved 600 nm (OD _600). Grow kultur før OD ₆₀₀ ~ 0,8.
   1. For C-og C-SH3 _lig, indusere proteinekspresjon ved tilsetning av isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til kultur (1 mM endelig konsentrasjon) og inkuberes kulturen ved 37 ° C i 4 timer under rysting ved 250 rpm.
   2. For N-og SH3-GFP, avkjøles kulturen til ~ 18 ° C ved neddykking av kulturkolben i et is vannbad i ~ 5 min. Indusere proteinekspresjon ved tilsetning av IPTG til kulturen (1 mM endelig konsentrasjon) og inkuberes kulturen ved 18 ° C i 14-18 timer under rysting ved 250 rpm.
6. Etter proteinekspresjon, sentrifuger kulturen ved 6000 xg i 20 min ved 4 ° C for å samle opp pelleten. Lagres cellepelleten ved -80 ° C inntil bruk.

Tre. Protein Rensing

1. Rensing av N (denaturering forhold)
   1. Resuspender cellepelletene i buffer A (tabell 2) ved 10 ml / g fuktig pellet.
   2. Immerse pelleten suspensjonen i et is-vann-bad og forstyrre cellene ved sonikering (Amp 10, med en sek puls og 6 sek pause i 1 min).
   3. Sentrifuger lysatet ved 16 000 xg i 20 min ved 4 ° C.
   4. Kast supernatanten. Resuspender pellet i Buffer DA (inneholdende 8 M urea) og sentrifuger suspensjonen ved 16 000 xg i 20 min ved 4 ° C.
   5. Før supernatanten gjennom en 5 ml Ni-nitrilotrieddiksyre (NTA) kolonne ekvilibrert med buffer DA.
   6. Vask kolonnen med 30 ml buffer DA supplert med 45 mM imidazol. Eluer renset protein under anvendelse av 20 ml av Buffer DA supplert med 150 mM imidazol.
   7. Reduser urea-konsentrasjon i proteinprøven til <1 mM av enten en av de følgende fremgangsmåter som er angitt i 3.1.7.1 eller 3.1.7.2:
      1. Dialyser protein i DPBS-buffer (tabell 2) ved 4 ° C over natten ved bruk av rør med <20 kDa cutoff.
      2. Sentrifuger renset protein i en 30 & #160; kDa ultra-filtrering spinnkolonne ved 2800 x g, 4 ° C inntil volumet er mindre enn 1 ml. Legg 14 ml DPBS-buffer til kolonnen for å fortynne protein prøven. Gjenta sentrifuger / fortynning trinn tre ganger til.
   8. Etter bufferutveksling, tilsett ditiotreitol (DTT) til det rensede protein (slutt 2 mM) og konsentrere protein til ~ 100 mg / ml ved sentrifugering gjennom en 30 kDa ultra-filtrering spinnkolonne ved 2800 x g, 4 ° C.
   9. Alikvot den konsentrerte protein og oppbevar ved -80 ° C inntil bruk.
2. Rensing av C og C-SH3 _LIG (native tilstand)
   1. Resuspender cellepelletene i buffer B (pH 6,0) (tabell 2) supplert med 1x protease inhibitor cocktail ved 10 ml / g fuktig pellet. Bruk sure buffer for å redusere proteolytisk nedbrytning av målproteinet.
   2. Forstyrre cellesuspensjon ved sonikering som beskrevet i 3.1.2. Sentrifuger lysspiste på 16 000 xg i 20 min ved 4 ° C og holde den overliggende væske.
   3. Før oppløselig lysat gjennom en 5 ml Ni-NTA-kolonne ekvilibrert med buffer B.
   4. Vask kolonnen med buffer B supplementert med 45 mM imidazol, og eluering av målprotein i 20 ml buffer B supplementert med 150 mM imidazol.
   5. For C, hopp til trinn 3.2.6. For C-SH3 _LIG, gjennomføre en ekstra ion-exchange rensetrinn for å fjerne delvis nedbrutt protein som angitt i trinn 3.2.5.1 til 3.2.5.3
      1. Reduser NaCl-konsentrasjonen i C-SH3 _lig til <1 mM å følge prosedyren beskrevet i 3.1.7.
      2. Laste målproteinet på en 5 ml anionbytter perle agarose matrisekolonne ekvilibrert med natriumfosfat-buffer (50 mM, pH 7,0).
      3. Elute målprotein fra kolonnen ved å kjøre en gradient fra en oppløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer til en oppløsning inneholdende den samme buffer supplert med 1 M NaCl. Ta prøver under eluering protein og basseng prøvene med den høyeste renhet basert på natrium-dodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE).
   6. Buffer bytte ut det rensede protein i DPBS-buffer, som beskrevet i 3.1.7.
   7. Legg DTT til det rensede protein (sluttkonsentrasjon 2 mM) og konsentrere proteinet til ~ 100 mg / ml ved bruk av en 30 kD ultrafiltreringsspinnkolonne som beskrevet i 3.1.8. Delmengde og lagre konsentrert protein ved -80 ° C inntil bruk.
3. Rensing av SH3-GFP
   1. Resuspender cellepelletene ved hjelp av buffer A ved 10 ml / g fuktig pellet.
   2. Forstyrre pelleten suspensjonen ved sonikering som beskrevet i 3.1.2.
   3. Sentrifuger lysatet ved 16 000 xg i 20 min ved 4 ° C og samle supernatanten.
   4. Før supernatanten (oppløselig lysat) gjennom en 5 ml Ni-NTA-kolonne ekvilibrert medBuffer A.
   5. Vask kolonnen med 30 ml buffer A supplert med 45 mM imidazol. Eluer rensede protein ved hjelp av 20 ml av Buffer A supplementert med 150 mM imidazol.
   6. Buffer bytte ut det rensede protein i DPBS-buffer ved bruk av en metode lik den som er beskrevet i 3.1.7 og konsentrere proteinet til ~ 150 mg / ml ved bruk av en 30 kD ultrafiltreringsspinnkolonne som beskrevet i 3.1.8.
   7. Delmengde og lagre renset protein ved -80 ° C inntil bruk.
4. SDS-PAGE-analyse av rensede prøver som inneholder CutA
   1. Fortynn hver renset protein i dobbelt-destillert vann for å redusere konsentrasjonen av NaCl til ~ 1 mM. På denne NaCl-konsentrasjon, det meste av CutA trimer proteiner kjørt som monomerer på SDS-PAGE-geler.
   2. Bland prøver med 2 x SDS-prøvebuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% glycerol, 10% w / v SDS, 0,1% vekt / volum brom-fenol blå, 2% β-merkaptoetanol), inkubert ved 95 ° C i 5 min.
   3. Legg den sameksempler på en 12% SDS-PAGE gel. Utføre elektroforese på en konstant spenning på 200 V for ~ 50 min.
   4. Observer protein i gelene ved farging med Coomassie brilliant blue R250 å følge standardprotokoller (figur 1C).

4. Hydrogeldannelse

MERK: eksempel hydrogeler gjort i denne studien inneholder 1,6 mM av hver hydrogel byggestein med mindre annet er angitt. Denne proteinkonsentrasjon gir en myk, stabil hydrogel. FORSIKTIG: Natriumazid (NaN ₃₎ tilsettes til den hydrogel til en endelig konsentrasjon på 0,5% vekt / volum for å forhindre bakteriell forurensning. NaN ₃ er svært giftig og må håndteres med ekstrem forsiktighet som angitt i HMS-datablad.

1. Beregn volumet for hver av de konsentrerte proteiner som trengs for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1,6 mM i en 100 ul prøve hydrogel. For eksempel:
   Konsentrasjon av N:100 mg / ml
   Molekylvekten av N: 26,3 kDa (se Tabell 1)
   Ønsket Volum: 100 mL Ønsket Konsentrasjon: 1,6 mM
   
2. For å gjøre en 100 pl hydrogel (1,6 mM), bland C (x pl, volum beregnet til 4,1) med 5% NaN ₃ (10 ul), 100 mM DTT (5 ul), og N (y ul, volum beregnes ifølge 4.1) i en 2 ml hetteglass.
3. Legg DPBS-buffer ((85 - x - y) il) til ampullen for å oppnå et sluttvolum på 100 mL, og manuelt blande alle komponentene via en hvirvlende bevegelse ved hjelp av en pipette. Merk: Løsningen blir veldig tyktflytende ved risting.
4. Sentrifuger blandingen i 2 min ved 8000 x g for å fjerne luftbobler.
5. Inkuber blandingen ved værelsetemperatur over natten for å tillate at intein trans-spleising reaksjonen å nå fullførelse. Bekreft hydrogel formasjon ved å snu røret opp ned. Proteinene vil ikke flyte dersom en hydrogel dannes.
6. Estimer intein trans-spleising utbytte ved å kontrollere prøver (0,5 mL hver) som samles før trinn 4.2, og etter trinn 4.5 på en SDS-PAGE gel, som beskrevet i 3.4 (figur 1C).

5. Immobilisering av GFP via Docking Protein (DP) og Docking Station Peptide (DSP) Interaksjon

1. For å gjøre en 50 pl GFP-funksjonalisert hydrogel (1,2 mM), kombinere C-SH3 _lig (x pl, beregnet i henhold til 4.1) og SH3-GFP (y ul, beregnet i henhold til 4.1) på 01:01 molarforhold på 1,7 ml mikrosentrifugerør og inkuberes blandingen ved romtemperatur i 30 min.
2. Tilsett 5% NaN ₃ (5 ul), 100 mM DTT (2,5 ul), (42,5 - x - <em> y) mL DPBS til det samme røret. Tilsett N (y ul, beregnet i henhold til 4.1) for å oppnå en 1:1 molart forhold av N-og C-SH3 _lig. Bland prøven ved hjelp av en pipettespiss med en hvirvlende bevegelse.
3. Sentrifuger blandingen ved 8000 x g i 2 minutter, og inkuberes blandingen ved romtemperatur natten over i mørket. En hydrogel innkapsle SH3-GFP former under inkubasjon.

6. Bruk av 1,6 mM Hydrogel som en Immobilization Stillas for enzymatisk reaksjon i organisk løsemiddel

1. Bruk HRP som modell enzym. Forbered en stamløsning av HRP (28 mg / ml eller 0,63 mM) i DPBS.
2. For å gjøre en 30 pl hydrogel (1,6 mM) som omslutter HRP, kombinere C (x pl, beregnet i henhold til 4.1) med HRP (2 mL), 5% NaN _{3 (3} mL) og DTT (1,5 pl av 100 mM) i en 1,7 ml sentrifugerør.
3. Legg N (y </ Em> ul, beregnet i henhold til 4.1) og DPBS (23,5 - x - y) ul. Bland med en pipette spissen med en virvlende bevegelse.
4. Sentrifuger blandingen ved 8000 x g i 2 minutter, og inkuberes ved romtemperatur natten over.
   FORSIKTIG: Regents brukes til følgende aktivitet analysen er svært giftige. Bruk spesifikke sikkerhetstilrådinger etter de tilsvarende sikkerhetsdatablad.
5. For enzymatisk reaksjon, senk hydrogel i 1 ml av reaksjons cocktail inneholdende N, N-dimetyl-p-fenylen-diamin (5,8 mM), fenol (5,8 mM) og tert-butyl-hydroperoksyd (2,9 mM) i n-heptan ^14. Forstyrre manuelt under anvendelse av en pipette for å øke kontaktoverflatearealet av hydrogel og oppløsningsmidlet.
6. Detect HRP produkt, en indophenol-type fargestoff, ved å måle den optiske absorbans av prøver som er tatt på forskjellige tidspunkter ved 546 nm på en plateavleser (figur 5).
</ Ol>

Representative Results

En skjematisk for intein-mediert protein hydrogel dannelse er vist i figur 1A. Byggesteinene i hydrogel er proteinet kopolymerer CutA-NpuN (N) og NpuC-S-CutA (C) (Figur 1A, Tabell 1). NpuN / C er de N-/C-fragments av naturlig delt DnaE intein fra Nostoc punctiforme (NPU). CutA er stabile trimere protein fra Pyrococcus horikoshii ^4,5. Blanding av renset N-og C i nærvær av reduksjonsmidlet DTT induserer dannelsen av et tredje protein - det ligert produkt (J: CutA-S-CutA) (figurene 1A og 1C). Individuelt, de hydrogel byggeklosser N og C eksistere som viskøse væsker (Figur 1b). Blanding av N-og C gir et gjennomsiktig halv-fast materiale som holdes tilbake på bunnen av et hetteglass etter inversjon, indikerer dannelsen av en hydrogel ^15,16 (figur 1 B) ^ett8,19.

Dette intein-mediert protein hydrogel (1,6 mm) viser høy stabilitet løsning. Det er lite til intet tap av tverrbundet hydrogel stillaset etter 21 dager ved 22 ° C i DPBS-buffer, som den totale mengde protein slippes ut i DPBS-buffer bare svakt overstiger den teoretiske mengde av den spleisede intein fra hydrogel (forutsatt at 100 % intein trans-spleising effektivitet) (Figur 3A). Densitometry avslørte at i løpet hydrogeldannelse, trans-spleising reaksjoner var ~ 80% effektiv (figur 1C). SDS-PAGE-gel-analyse viste at bare spor av trans-skjøtes produktet var til stede i hydrogelen omliggende buffer (figur 3B, bånd J), noe som bekrefter at tap av den tverrbundet hydrogel stillaset for erosjon er minimal. Hoved protein til stede i hydrogelen omliggende buffer blir den spleisede ut intein. Ingen synlige tegn på erosjon ble observert ien uforstyrret hydrogel neddykket i vandig oppløsning ved romtemperatur i mer enn 3 måneder (figur 3A) innløp. Hydrogelen er også svært stabil ved 37 ° C (figur 3C) og i både sure og basiske buffere (figur 3D).

For å lette immobilisering protein, ble et par av protein og peptid-ligand anvendes for å forankre proteiner av interesse inn i hydrogel stillaset. Vi valgte SH3 protein, et Src-homologi 3 domene fra adapteren protein CRK, ettersom forankrings protein (DP) for fusjon til et protein av interesse, og dens ligand (SH3 _ly) som dokkingstasjonen peptid (DSP) for inkorporering i hydrogel stillaset. Denne interaksjonen paret ble valgt på grunn av den relativt lille molekylstørrelse (56 aa for SH3 og 11 aa for SH3 _lig) og høy affinitet (k _d = 0,1 mm) ^17,18. SH3 _LIG ble satt inn mellom NpuC og CutA å danne C-SH3 _LIG(Tabell 1). Den SH3 protein ble fusjonert til N-terminalen av en modell target globular protein, grønt fluorescerende protein (GFP) og danner SH3-GFP. Prosessen er beskrevet i protokollen (§ 5, figur 4A) gir en hydrogel som inneholder 1,2 mM trans-skjøtes hydrogel ryggrad byggeklosser og 1,2 mM GFP. Den GFP-holdige hydrogel oppviste en lignende stabilitet til hydrogel mangler GFP (figur 4B) med ~ 35% totale proteintapet etter 21 dager i DPBS-buffer. De fleste proteinene som er tilstede i erosjons buffer ble de spaltede inteins. Den utlutningshastighet på SH3-GFP fra en hydrogel som inneholder SH3 _lig er ~ 30% etter 3 uker, betydelig mindre enn det fra en hydrogel mangler SH3 _LIG (> 70% proteintapet i samme tidsrom, Figur 4C). Den immobilisert SH3-GFP i hydrogel gløder under UV lys. Som vist i figur 4D, hydrogel inneholdende dokkingsstasjonen peptide SH3 _LIG beholder mesteparten av GFP fluorescens etter tre uker mens hydrogel mangler SH3 _ly blir i hovedsak nonfluorescent. Det er ventet at bruken av en høyere affinitet DP / DSP paret kan ytterligere redusere utlutningshastighet på det immobiliserte protein.

I dette eksperimentet, ble GFP brukt som målet protein, men kan enhver DP-merket protein være beleilig immobilisert i denne hydrogel. Derfor bør intein-mediert protein hydrogel gi en generell stillas for protein immobilisering. Tettheten av immobilisert GFP viser i dette arbeidet er ~ 33 mol% av den hydrogel. En høyere immobilisering tetthet kan potensielt bli oppnådd ved flere DSP er innlemmet i hydrogelen byggeblokk.

Deretter ble enzymet HRP innlemmet i proteinet hydrogel som viser evne til å støtte biocatalysis i organiske oppløsningsmidler. Enzymaktiviteten ble målt ved å overvåke den oksidative kobling av N-dimetyl-p-fenylen-diamin og fenol med tert-butyl hydroperoksid over tid ^14. Hypotesen var at det hydratiserte miljø av hydrogel vil beskytte den vedlagte enzym fra den denaturerende virkning av det organiske løsningsmiddel. Hydrogeler inneholdende 0,042 mM HRP ble nedsenket i n-heptan inneholdende substrater. Etter neddykking i organisk oppløsningsmiddel, ble HRP-holdige hydrogel manuelt brutt opp i små klaser for å øke den hydrofile-hydrofobe grensesnittområdet (figur 5B). Hydrogel-inkorporert HRP effektivt katalysert den raske oksidasjonsreaksjon, noe som gir opphav til en kolorimetrisk produkt (figur 5C, trekanter). Produktet ansamling følger en lineær bakke, indikerer liten til ingen enzym-inaktivering i løpet av eksperimentet. Styre reaksjon med HRP oppløst direkte i den organiske reaksjons cocktail oppviste ubetydelig katalytisk aktivitet på grunn av enzym denaturering (data ikke vist). HRP oppløst i DPBS først, etterfulgt av tilsetning i det organiske løsningsmiddel var i stand til å katalysere omdanningen, men til en mye lavere reaksjonshastighet (figur 5C, sirkler). Den lave konverteringshastighet på enzymer oppløst i DPBS er sannsynlig på grunn av den lille grenseflateområdet mellom DPBS og det organiske oppløsningsmiddel, noe som begrenser hastigheten av underlaget / produkt diffusjon. Inkorporering av den svært hydrofile S fragment i hydrogel ryggraden, noe som effektivt kan "låses" i vannet inne i hydrogelen og hindrer at det organiske oppløsningsmiddel for å få tilgang til hydrogel indre, gjør det mulig for hydrogelen til å tåle den denaturerende virkning av organisk løsningsmiddel. Disse resultatene indikerer at den intein-mediert protein hydrogel kan være en effektiv stillas for enzymatiske reaksjoner i organisk løsningsmiddel.

_upload/51202/51202fig1.jpg "/>
Figur 1. Intein-mediert protein hydrogel. (A) Skjematisk av intein trans-spleising reaksjon som utløser dannelsen av en lengre proteinkjede (J) med tverrbindingsproteiner i begge termini. Crosslinker proteiner fra flere J protein kjeder kovalent førsteamanuensis, og ved intein-mediert protein ligation, indusere dannelsen av et sterkt tverrbundet protein nettverk med hydrogel egenskaper. NpuN / C: intein N-/C-fragment. (B) Blanding av renset N-og C (8,3% w / v) fører til dannelsen av en sterkt tverrbundet hydrogel nettverk (1,6 mM J). (C) SDS-PAGE-analyse av renset N-og C-byggeblokker før og etter blanding. "N + C" tilsvarer en prøve som er tatt direkte fra en 1,6 mM hydrogel. "*" Betegner et intein C-terminalt spaltningssete SIde reaksjonsprodukt. Intensitet av hvert band ble kvantifisert ved hjelp av "spor modulen i" Antall One "programvare. Band intensitet ble dividert med proteinmolekylvekt for å oppnå den molare ekvivalent. Trans-spleising effektivitet (~ 80%) ble beregnet fra mengden av produktet J og uomsatt N / C i den samme bane. Gjengitt med tillatelse fra Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klikk her for å se større bilde.

Figur 2. Plasmidkart over protein konstruksjoner. (A) CutA-NpuN, (B) NpuC-S-CutA og (C) SH3-GFP (<strong> Tabell 1) ble klonet inn pET26b vektor under kontroll av T7 promoter. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3. Stabilitet av intein-medierte protein hydrogeler i DPBS. (A) Erosjons profil av en 1,6 mM hydrogel ved 22 ° C. Prikket linje representerer den teoretiske massen av kløyvde inteins. Innløpet viser en uforstyrret hydrogel i DPBS etter 3 måneder ved romtemperatur. (B) SDS-PAGE analyse av hydrogel omgi buffer. Alle prøvene i bufferen hvori hydrogel ble nedsenket i (A) ble slått sammen (totalt 7,5 ml) og konsentrert 75 ganger ved ultrafiltrering gjennom en 10 kDen membran før gel lasting J:. intein trans-skjøtes produkt N:.. ureagert CutA-NpuN NpuN: skjøtes ut N-intein fragment. Ureagert C og skjøtes ut NpuC er ikke synlige i gelen på grunn av den lille mengde og liten størrelse (4 kDa), henholdsvis. Stjernen betegner uidentifiserte band. (C) Erosjons profil av hydrogel inkubert ved forskjellige temperaturer. (D) Erosjons profil av hydrogeler inkubert ved to forskjellige pH-verdier. Gjengitt med tillatelse fra Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klikk her for å se større bilde.

Figur 4. Intein-mediert hydrogel støtter immobilisering av funksjonelle globulære proteiner. (A) Skjematisk fremstilling av protein ved hjelp av immobilisering GFP som modell globular protein. Det DSP-holdige hydrogel byggeblokk blir først blandet med DP-smeltet målprotein for målprotein settes inn i byggeklossen. Den komplementære intein fragment-inneholdende hydrogel byggestein blir tilsatt til blandingen som gir et hydrogel med immobilisert GFP. (B) Total protein erosjonsprofil for hydrogel inneholdende 01:01 molforhold mellom SH3-GFP. Prikket linje representerer den teoretiske massen av de skjøtes ut inteins. De feilfelt representerer standardavviket to uavhengige eksperimenter. (C) Utvasking profil av SH3-GFP fra hydrogel med og uten DSP. (D) Bilder av GFP inneholdende hydrogeler i henhold til UV-stråling umiddelbart etter hydrogel dannelse og etter 21 dager. Gjengitt med tillatelse fra Journal of American Chemical Society (doi:. 10.1021/ja401075s) Klikk her for å se større bilde.

Figur 5. Pepperrot-peroksydase (HRP)-innesluttet intein-utløste protein hydrogel letter HRP-katalysert reaksjon i organisk oppløsningsmiddel n-heptan. (A) Modell reaksjon katalysert av HRP i organiske oppløsningsmidler. (B) Fotografi av hydrogeler inneholdende innkapslet HRP etter å ha blitt forstyrret i små fragmenter og inkubert i en reaksjons cocktail i 10 min og 30 min (til venstre) og styre eksperiment med samme mengde nonimmobilized HRP i DPBS-buffer (til høyre). (C) Produktdannelse ble overvåket ved absorbans ved 546 nm. Tilpasset med tillatelse fra Journal of Amerikan Chemical Society. (doi: 10.1021/ja401075s) Klikk her for å se større bilde.

Tabell 1. Protein konstruerer brukt i denne studien.

Kort navn	Protein Sequence	MW (kDa)
CutA-NpuN (N)	CutA-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-hhhhhh	26.3
NpuC-S-CutA (C)	NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C uta- Hhhhhh	26.1
NpuC-S-SH3 lig - CutA (C-SH3 LIG)	NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS- PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-CutA-hhhhhh	28,3
SH3-GFP	SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-hhhhhh	34.5

Gjengitt med tillatelse fra Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

Tabell 2. Buffer komposisjoner.

Buffer A	500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0
Buffer DA	500 mM NaCl, 8 M urea, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0
Buffer B	500 mM NaCl, 50 mM NaPOi, pH 6,0
DPBS	Dulbeccos PBS, 137,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4

Gjengitt med tillatelse fra Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

Discussion

I dette arbeidet, viste vi syntesen av en svært stabil intein-mediert protein hydrogel. Bruk av et delt muliggjør intein hydrogel som skal betinget dannet i respons til en blanding av to væske-fase-komponenter. Nærmere bestemt, intein kovalent forbinder split to væske-fase byggeklosser via en trans-spleising reaksjon, noe som gir et polypeptid enhet flankert ved tverrbinding enheter som i sin tur selv setter sammen til en hydrogel. Blandingen-indusert dannelse av hydrogelen omgår tekniske vanskeligheter i syntesen av enkeltkomponent-protein hydrogeler hvor gel-mediert tilstopping av kromatografiske rensekolonner kan oppstå. Videre hydrogel former under fysiologiske betingelser uten behov for noen overflødige kjemiske induserende og / eller fysiske utløsere.

Den intein-mediert hydrogel beholder høy stabilitet både i sure og basiske buffere, og ved fysiologisk temperatur. Hydrogeler kan danne with så lite som 0,8 mM av hver enkelt byggeblokk (data ikke vist), men høyere proteinkonsentrasjon (~ 1,6 mM) avlings hydrogeler med bedre mekanisk stabilitet. Hydrogelen høye stabilitet er knyttet til bruk av 1) en meget stabil trimere protein, CutA, som et tverrbindingsmiddel, og 2) intein for kovalent å slutte forskjellige tverrbindingsmidler. Densitometrisk analyse av SDS-PAGE-geler viste at ca 80% av det innførte protein med hell gjennomgikk splitten intein-katalysert trans-skjøting reaksjon.

For hydrogel formasjonen, blir de enkelte byggeklosser først konsentrert til ~ 100 mg / ml. Et reduksjonsmiddel, så som DTT, må være til stede i løpet av proteinkonsentrasjonen steg til å hindre dannelsen av intermolekylære disulfidbindinger. I fravær av reduksjonsmiddel, kan konsentrert individuelle hydrogel byggestein noen ganger danner hydrogel-aktig materiale. Imidlertid løser dette gel-lignende materiale som hurtig når nedsenket i en buffer og / eller i nærværreduksjonsmiddel.

For å oppnå en hydrogel med maksimal stabilitet, er det viktig å sikre at det molare forhold av de to hydrogel byggeklosser er 1:1. Eventuelle overskytende byggestein vil ikke være tverrbundet, og kan påvirke hydrogel største mekaniske egenskaper. Konsentrert protein må alikvoteres og lagres hver for seg for å minimalisere gjentatte fryse-tine-sykluser.

Vi har også vist at bruken av intein-mediert protein hydrogel som et organisk-løsningsmiddel-forenlig biokatalysator. Nærmere bestemt, hydrogeler som omfatter enzymet HRP ble nedsenket i n-heptan inneholdende substratet og vellykket omdanning av substrat til produkt ble observert. Proteinet hydrogel tjener som en effektiv stillas for biokatalyse i organisk oppløsningsmiddel sannsynligvis på grunn av beskyttelse av organisk-løsningsmiddel-formidlet denaturering tilbys av sterkt hydratiserte miljø av hydrogel.

En av begrensningene i ther enzymet immobilisering teknologi er behovet for å smelte målprotein med en forankrings peptid (DP). Denne endringen kan påvirke aktivitet og løseligheten av noen mål protein og dermed kreve sak-til-sak optimalisering av DP-tagget protein konstruksjoner. I tillegg ble en liten mengde av kodede proteiner vasket ut av dokk peptid (DSP)-holdig hydrogel etter 1 uke. Stabiliteten til det immobiliserte protein påvirkes av affiniteten til DSP / DP-par. For å oppnå bedre immobilisering effektivitet, vil en høyere affinitet DSP / DP paret være nødvendig. Endelig, dette hydrogel utstillinger relativt svak mekanisk eiendom på grunn av den lave platået lagringsmodul (100-200 kPa) ^9. Platået lagringsmodul påvirkes av strukturer både tverrbindingsmiddelet og midblock ^19.. I den nåværende hydrogel, en trimer protein anvendt som tverrbindingsmiddel. Bruken av tverrbinder protein med en høyere multimere tilstand potensielt kan øke hydrogel platå stOrage modulus og dens mekaniske eiendommen.

I sammendrag, rapporterer at det er syntese og karakterisering av et nytt protein hydrogel som betinget dannes ved blanding av to væske-fase protein byggeklosser, hver inneholdende en halvpart av en splittet intein. Intein-mediert protein hydrogeler representerer et lovende nytt materiale med potensielle anvendelser i syntetiske enzymatiske reaksjoner, organisk syntese, injiserbare levering av legemidler, og tissue engineering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530S
Competent Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazole	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-5
Protease Inhibitor cocktail	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Caution, highly toxic
Horseradish peroxidase	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine	Fisher	AC408460250	Caution, highly toxic
phenol	Fisher	AC149340500	Caution, highly toxic
tert-butyl hydroperoxide	Fisher	AC180340050	Caution, highly toxic
n-heptane	Acros Organics	120340010

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuge	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Ultrafiltration Tubes	Amicon Ultra	UFC903024
Ni Sepharose High Performance HisTrap column	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM