Imunofluorescência indireta (IFI) ensaios têm sido tradicionalmente utilizados para a detecção de anticorpos antinucleares (ANA) no soro humano. A presença destes anticorpos pode ajudar no diagnóstico de doenças reumáticas sistémicas auto-imunes (SARD). Este protocolo demonstra como executar efetivamente a técnica IIF para detectar com precisão essas auto-anticorpos.
O Colégio Americano de Reumatologia declaração de posição sobre o teste ANA prevê o uso de IIF como o método padrão-ouro para ANA triagem 1. Embora IIF é um teste de rastreio excelente nas mãos de especialistas, as dificuldades técnicas de processamento e leitura IIF desliza – como o processamento intensivo trabalho de slides, leitura manual, a necessidade de experiente, tecnólogos formados eo uso de quarto escuro – tornar o método IIF difíceis de encaixar no fluxo de trabalho de, laboratórios automatizados modernos.
O primeiro e fundamental passo para a alta qualidade de triagem ANA é o processamento de slides cuidado. Este procedimento é trabalhoso e requer uma compreensão completa do processo, bem como a atenção aos detalhes e experiência.
A leitura das lâminas é realizada por meio de microscopia de fluorescência em salas escuras, e é feito por técnicos treinados, que estão familiarizados com os vários padrões, no contexto do ciclo celulare a morfologia de interfase e células em divisão. Desde que IIF é a primeira ferramenta de triagem linha para SARD, compreender as etapas para executar corretamente essa técnica é fundamental.
Recentemente, sistemas de imagem digitais têm sido desenvolvidos para a leitura automática das lâminas de IFI. Estes sistemas, como o NOVA Ver Automated microscópio fluorescente, são projetados para simplificar o fluxo de trabalho IIF rotina. NOVA Ver adquire e armazena imagens digitais de alta resolução dos poços, separando assim a aquisição de imagem a partir de interpretação; imagens são visualizadas uma interpretadas em monitores de computador de alta resolução. Ele armazena as imagens para referência futura e apóia a interpretação do operador, fornecendo dados de intensidade de luz fluorescente nas imagens. Também categoriza preliminarmente resultados como positivos ou negativos, e proporciona o reconhecimento de padrões para as amostras positivas. Em resumo, o que elimina a necessidade de câmara escura, e automatiza e simplifica o readi IIFng / interpretação do fluxo de trabalho. Mais importante, ele aumenta a consistência entre leitores e leituras. Além disso, com o uso de lâminas com código de barras, os erros de transcrição, são eliminados pelo fornecimento de rastreabilidade da amostra e identificação positiva do paciente. Isto resulta num aumento da integridade e da segurança dos dados do paciente.
O objetivo geral deste vídeo é demonstrar o procedimento IIF, incluindo processamento de slide, identificação de padrões comuns IIF, ea introdução de novos avanços para simplificar e harmonizar esta técnica.
O termo anticorpos antinucleares (ANA) descreve uma variedade de auto-anticorpos que reagem com os componentes de núcleos de células, incluindo DNA, proteínas e ribonucleoproteínas 1, 2. A células HEp-2, um array de proteínas nativas com centenas de antigénios, fornece um substrato ideal para a detecção de ANA 1. A detecção de ANA no soro humano é uma importante ferramenta de triagem para doenças do tecido conjuntivo, e IIF é o método de referência para o teste ANA 1. Recentemente, IFI em células HEp-2 tem sido substituído, em alguns laboratórios com imunoensaios específicos para o antigénio e os métodos de multiplex. Devido a preocupações com resultados falsos negativos ea falta de transparência para os médicos, o Colégio Americano de Reumatologia formado um Grupo de Trabalho que concluiu que IFI utilizando células HEp-2 deve ser o "padrão ouro" para a ANA triagem 1.
Devido à natureza subjetiva de triagem ANA, a qualidade das células HEp-2 éTegral de relatórios precisos e confiante dos resultados. A presença de um elevado número de células mitóticas, a morfologia óptima de células, confluência suficiente, e a expressão de antigénios relevantes são particularmente importantes. Reconhecimento de padrões IIF serve como uma importante ferramenta para auxiliar no diagnóstico do paciente. Compreender o significado de vários padrões permite que os médicos e pessoal de laboratório para realizar o teste apropriado de acompanhamento para confirmar o diagnóstico. Por exemplo, homogénea padrão ANA pode ocorrer na presença de anti-dsADN ou anticorpos de cromatina, e podem estar associados com lúpus eritematoso sistémico (LES) 3. Do outro lado, foi recentemente descrito que o assim chamado padrão pontilhado fino denso (DFS) que é frequentemente observado em até 12% de amostras de rotina, tem sido principalmente associada com anticorpos anti-DFS70. Esses auto-anticorpos, quando encontrado em isolamento (sem outra doença específica ANA) não estão associados com doenças reumáticas autoimunes sistêmicas <sup> 4-9. Assim, o teste confirmatório para detecção de anticorpos anti-DFS70 pode ajudar a reduzir os testes de reflexo desnecessário, oferecer consideráveis economias de custos e aliviar a ansiedade do paciente.
Dado que IIF é a primeira metodologia de triagem linha para detectar auto-anticorpos, é fundamental que o usuário entenda como a selecção de reagentes e substratos de tecido podem afetar os resultados. Uma vez que a técnica de IFI é inerentemente subjectiva, é importante que os reagentes utilizados fornecer os resultados da mais alta qualidade.
Este objetivo deste protocolo de vídeo é familiarizar o usuário com os passos corretos necessários para executar o método IIF, os padrões comuns associados com a ANA, e introduzir novos avanços que podem agilizar o fluxo de trabalho de laboratório e padronizar resultados.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Cassandra Bryant para a realização do experimento IIF e Carol Buchner para ela especialista revisão técnica.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
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