المخدرات التي يسببها-توعية انزيمات محلقة: تبسيط الفحص والتصغير لجزيء صغير وسيرنا تطبيقات الفحص
Summary
تنشيط دائم لG-البروتين يقترن مستقبلات نتائج المثبطة في توعية أدينيليل محلقة الإشارة. لتحديد المسارات الجزيئية الأساسية، ونهج nonbiased ضرورية، ولكن هذا يتطلب استراتيجية تطوير خلية مقرها قابلة المخيم توعية الفحص. هنا، نحن تصف مقايسة لتوعية جزيء صغير وسيرنا الفرز.
Abstract
وقد تورط توعية أدينيليل محلقة (AC) إشارات في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية والنفسية والعصبية بما في ذلك تعاطي المخدرات ومرض الشلل الرعاش. تفعيل الحاد في Gαi / المستقبلات المرتبطة س يثبط النشاط AC، بينما تنشيط دائم لهذه النتائج المستقبلات في توعية مغاير من AC وزيادة مستويات مخيم داخل الخلايا. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هذا تعزيز الاستجابة AC لوحظ سواء في المختبر والمجراة عقب تفعيل المزمن من عدة أنواع من المستقبلات Gαi / س مرتبطة بما في ذلك مد 2 الدوبامين وμ مستقبلات المواد الأفيونية. على الرغم من أن أفيد غيري من التوعية AC للمرة الأولى منذ أربعة عقود، آلية (ق) التي تكمن وراء هذه الظاهرة لا تزال مجهولة إلى حد كبير. عدم وجود بيانات الآلية يعكس يفترض أن التعقيد مع هذا الرد على التكيف، مما يشير إلى أن النهج nonbiased يمكن أن تساعد في تحديدجي المسارات الجزيئية المشاركة في توعية مغاير من AC. وقد تورط الدراسات السابقة كيناز وGbγ إشارات على أنها متداخلة المكونات التي تنظم توعية مغاير من AC. لتحديد أهداف إضافية فريدة ومتداخلة المرتبطة توعية AC، مطلوب تطوير والتحقق من صحة قابلة للمقايسة المخيم توعية لزيادة الإنتاجية. النهج السابقة لدراسة توعية عموما مرهقة تنطوي على خلية المستمر الصيانة الثقافة وكذلك منهجية معقدة لقياس تراكم المخيم الذي ينطوي على خطوات غسل متعددة. وبالتالي، فإن تطوير فحص خلية مقرها قوية والتي يمكن استخدامها لفحص إنتاجية عالية (HTS) في شكل جيد 384 تسهيل الدراسات المستقبلية. باستخدام اثنين من مستقبلات الدوبامين D 2 نماذج الخلوية (أي. CHO-D-2L وكلوة الجنين البشري AC6 / D 2L)، ونحن لدينا فحص وتحويلها توعية 48 جيدا (> 20 الخطوات 4-5 أيام) إلى خمسة لياليTEP، مقايسة يوم واحد في شكل 384 جيدا. هذا الشكل الجديد هو قابل للفحص جزيء صغير، وعلينا أن نبرهن على هذا التصميم الفحص يمكن أيضا أن تستخدم بسهولة لترنسفكأيشن سيرنا عكس تحسبا لاستهداف الفرز مكتبة سيرنا.
Introduction
تم اكتشاف أدينيليل محلقة التكيفية (AC) إشارة استجابة المعروفة باسم مغاير أو فائقة توعية الأولى في مختبر الحائز على جائزة نوبل، والدكتور مارشال Nirenberg. اقترح الدكتور Nirenberg أن زيادة الاستجابة AC لاحظ التالية تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية δ المزمنة كانت آلية المشاركة في التسامح الأفيونية والاعتماد 1. بالإضافة إلى تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية δ المزمن، يحدث هذا الرد neuroadaptive من AC يشير أيضا التالية تنشيط دائم لعدة Gαi / س يقترن مستقبلات أخرى 2. والجدير بالذكر أن العديد من هذه المستقبلات المقترنة مع الألم، والاضطرابات العصبية والنفسية والعصبية، وتشمل المواد الأفيونية μ / κ، D 2/4 الدوبامين، 5HT 1A، وM 2/4 مستقبلات المسكارينية 2. بالإضافة إلى النتائج د. Nirenberg، ومجموعة كبيرة من الأدلة التي تربط موجود توعية AC يشير إلى تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية المزمنة على حد سواء <eم> في المختبر والمجراة 3-7. كما تم المرتبطة توعية AC مع مجموعة متنوعة من الأمراض التي تنطوي على مستقبلات الدوبامين D 2 مثل بما في ذلك الفصام ومرض باركنسون (للمراجعة أنظر المرجع 2). على الرغم من الأهمية المحتملة للتوعية، وآلية دقيقة (ق) المرتبطة المستمرة Gαi / س يقترن تنشيط مستقبلات التي تؤدي إلى زيادة لا تزال مجهولة إلى حد كبير استجابة AC.
توفر هذه الدراسات الأساس المنطقي لدراسة آليات لتوعية أدينيليل محلقة كهدف مهم العصبية الحيوية. وبالمثل، ينبغي أيضا الاعتراف أهمية الفسيولوجية للAC إشارة 8 وأهمية أن عقد الأشكال الإسوية AC الفردية في هذه الاستجابة التكيفية 2،9،10. في سياق بحثنا، الملامح العامة المرتبطة توعية مغاير من الأشكال الإسوية المؤتلف من AC موازية تلك الخصائص قصرcribed لدراسة الأشكال الإسوية الذاتية للAC. على وجه التحديد، وقد وجدت الأبحاث السابقة أن تفعيل بروتينات Gαi / س ومفارز إطلاق اللاحقة / إعادة ترتيب βγ هي المتطلبات الهامة للمستقبلات التي يسببها توعية جميع الأشكال الإسوية AC. بالإضافة إلى ذلك، تشير العديد من الدراسات أن يشير من تحركات البروتينات ومفارز Gβγ يشاركون في التوعية 2،11-13. أيضا عرض التكييف الفردية أنماط فريدة من نوعها ومتميزة توعية 12. على سبيل المثال، يرتبط التعرض المستمر للمستقبلات D 2 لمنبهات مع توعية AC1 وAC8 لكا 2 + / كالمودولين التحفيز 14،15، في حين لم يتم توعيتهم على AC3 وثيقة الصلة 2. ترتبط AC2، AC4، وAC7 عن كثب، ومع ذلك، يتم توعيتهم فقط النشاط AC2 حفز PKC-بقوة بعد التعرض لفترة طويلة من مستقبلات D 2 إلى ناهضات 7،14،16،17. بالإضافة إلى ذلك، AC5 وAC6 تظهر درجة ملحوظة من شاذ؛ غير سويتوعية ologous إلى الغاز وحفز forskolin تراكم المخيم التالية تفعيل مستقبلات D 2 14،18-20، ولكن يبدو أن تختلف في ما يتطلبه Gβγ الوحيدات-AC التفاعلات 21. على الرغم من أن معظم الدراسات من AC توعية استخدمت خطوط الخلايا نموذج (مثل الخلايا HEK293 التعبير عن الأشكال الإسوية AC الفردية)، يبدو أن هذه النتائج تترجم إلى نماذج الخلايا العصبية الأصلي 4،22. في الآونة الأخيرة، وآثار AC الإسوي مثبطات جزيء صغير المحددة في الخلايا HEK293 التعبير عن الأشكال الإسوية AC يمكن أيضا أن تترجم إليها في الدراسات المجراة السلوكية 23.
من المرجح يعكس عدم وجود آلية الجزيئية التي تم تحديدها لتوعية مغاير تعقيد استجابة تكيفية وكذلك خصائص تنظيمية فريدة من نوعها للفرد AC الأشكال الإسوية 12. كشف هذه الدرجة من التعقيد يزداد تعقيدا من خلال استخدام منهجية مرهقة رقبعة محدودة المحققين الأكاديمية من استخدام نهج غير متحيز. على سبيل المثال، تشارك دراساتنا السابقة الآلي استخدام النماذج الخلوية مثقف باستمرار باستخدام 24 – و 48 جيدا زراعة الأنسجة شكل 15. وعادة ما نمت الخلايا المستزرعة لمدة 48 ساعة ثم تعرض لمعاملة المخدرات ناهض (2-18 ساعة)، يليه سلسلة من يغسل الخلايا وحضانات (الشكل 1). كان المخيم محددة بروتوكولات تراكم AC-الإسوي ثم يعمل تليها قياس تراكم المخيم باستخدام شاقة وتستغرق وقتا طويلا [3 H] المخيم منهجية 15،24 ملزمة. مدة من البداية الى النهاية لكل مقايسة مطلوب عموما ما مجموعه أربعة إلى خمسة أيام من الطلاء الخلية لتحليل البيانات (الشكل 1). وقد أدى تطبيق التكنولوجيات الجديدة والأتمتة إلى تحسينات ملحوظة للدراسات التوعية في الإعداد الصناعية ومركز HTS. على سبيل المثال، مجموعة العمل مع المركز الوطني للكيمىذكرت كال الجينوم اثنين يوم HTS إجراء فحص لتحديد جزيء صغير مثبطات مستقبلات المواد الأفيونية من μ يسببها التوعية في 1،536 جيدا شكل 25.
ويصف هذه المادة جهودنا لتطوير مقايسة HTS للدراسات توعية مغاير باستخدام التكنولوجيات المتوفرة في معظم المؤسسات البحثية الأكاديمية. تم إنجاز هذه الاستراتيجية من خلال دمج استخدام الخلايا cryopreserved من نماذج الخلايا معربا عن heterologously على مستقبلات الدوبامين D 2 في تركيبة مع الذاتية الفردية أو المؤتلف الأشكال الإسوية أدينيليل محلقة (CHO-D-2L أو كلوة الجنين البشري AC6 / D 2 L). لتحسين الإنتاجية لدينا، ونحن لدينا 48 إعادة تصميم جيدا مقايسة توعية (حوالي> 20 خطوات أكثر من 4-5 أيام) إلى خمس خطوات، مقايسة يوم واحد في شكل 384-جيدا أن كان أساسا "خلط وقراءة". يستخدم الشكل الجديد وقت متجانسة المتاحة تجاريا حل مضان (HTRF) فحص لقياس المخيم وفقumulation في خلايا سليمة مع لوحة متعددة وضع القارئ. مقايسة قوية وقابلة للفحص جزيء صغير، ويمكن تطبيقها على نحو فعال للكشف عن مثبطات للتوعية مغاير. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم البيانات التي يسمح استخدام هذا الاختبار مع ترنسفكأيشن عكس سيرنا لاستهداف أو الجينوم واسعة الفرز مكتبة سيرنا فقط مع تعديل طفيف على النهج العام.
Protocol
Representative Results
Discussion
في محاولة لتسهيل الدراسات التوعية مغاير، ونحن قد عدلت على نطاق واسع لدينا وسيلة مبسطة السابقة تحقيق "مزيج وقراءة" شكل غير قابلة للتعديل لالفرز الفائق الإنتاجية وآلية الفحص العمل. التعديلات الرئيسية لبروتوكول لدينا يمكن تلخيصها على النحو التالي: 1) استخدام الخل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه السيد ريتشارد زنك وتود Wiernicki للتدريب والتوجيه المنهجي الفحص. نشكر أيضا يوحنا بولس سبنس لقراءة متأنية والاقتراحات التحرير. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة MH 060397، الدماغ والسلوك مؤسسة البحوث، وايلي ليللي وشركة من خلال برنامج جائزة بحوث ليللي (LRAP).
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user’s guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A “genome-to-lead” approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
