Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes
Summary
Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.
Abstract
Con el fin de dirigirse a una sola proteína a múltiples orgánulos subcelulares, las plantas normalmente duplican los genes pertinentes, y expresan cada gen por separado utilizando estrategias regulatorias complejas incluyendo promotores diferenciales y / o secuencias de señal. Ingenieros metabólicos y biólogos sintéticos interesadas en la orientación de las enzimas a un orgánulo particular, se enfrentan a un desafío: Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen múltiples veces. Este trabajo presenta una solución a esta estrategia: aprovechar splicing alternativo del mRNA. Esta tecnología se aprovecha de cloroplasto establecido y secuencias de peroxisomas focalización y los combina en un único ARNm que se empalmados alternativamente. Algunas variantes de empalme se envían al cloroplasto, algunos hasta el peroxisoma, y algunos al citosol. Aquí, el sistema está diseñado para múltiples orgánulo que apunta con el corte y empalme alternativo. En este trabajo, se espera que las buenas prácticas agrarias para ser exprEssed en el cloroplasto, citosol, y peroxisomas por una serie de diseñados racionalmente 5 'etiquetas de ARNm. Estas etiquetas tienen el potencial de reducir la cantidad de clonación requerido cuando los genes heterólogos necesitan ser expresado en múltiples orgánulos subcelulares. Las construcciones fueron diseñadas en el trabajo anterior 11, y se clonaron utilizando el montaje de Gibson, un método de clonación independiente de ligación que no requiere enzimas de restricción. Los plásmidos resultantes se introdujeron en las células epidérmicas de la hoja de Nicotiana benthamiana con un protocolo modificado pistola de genes. Finalmente, las hojas transformadas se observaron con microscopía confocal.
Introduction
Este trabajo es un proyecto de ingeniería / biología sintética metabólica en la que las células vegetales están diseñados para expresar una proteína reportera en varios orgánulos, pero con una única construcción de ADN.
Un enfoque para dirigir proteínas a más de un lugar de clonación implica múltiples copias genéticas, cada uno que contiene un péptido de localización diferente. Cada copia debe ser introducida por los sucesivos retransformación, o alternativamente, por retrocruzamiento transformaciones individuales 1. Esto implica la clonación por adición, y está limitado por una etiqueta de localización por terminal.
Otra forma de localizar una proteína para múltiples ubicaciones es a través de splicing alternativo 2-5. ARN se transcribe a partir de un único gen, pero diferentes copias de la transcripción se procesa de manera diferente, a menudo en más de una forma por célula. Esto puede resultar en más de un ARN mensajero en la célula transcrito a partir de un único gen. Estos diferentes messengeARN R puede codificar para diferentes isoformas de la misma proteína, o en el caso de un desplazamiento del marco, una proteína totalmente diferente. Aunque splicing alternativo ha sido descrita en la literatura para muchos años, los mecanismos de acción y de donantes conservadas y sitios de empalme del receptor sólo están siendo elucidados más recientemente 6. A medida que se describen mejor estos sitios, se abren oportunidades para la ingeniería.
Ingenieros metabólicos Plant se enfrentan a un desafío cuando la expresión de una proteína en múltiples orgánulos. Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen varias veces, cada una con una secuencia señal separada dirigir a los orgánulos de interés. Para un solo gen en tres orgánulos, esto es simplemente tres genes. Sin embargo, para una vía metabólica de seis genes, esto se expande a 18 genes, un importante esfuerzo de clonación. Combinación de varias secuencias de localización en un único signo de genes empalmados alternativamente-reduce ificantly este esfuerzo. Por ejemplo, la reingeniería de la fotorrespiración 7,8 y la síntesis de isoprenoides 9,10 involucra tanto a los cloroplastos y peroxisomas. En nuestro caso nos aprovechamos de los sitios de empalme como se observa en un sistema de Arabidopsis thaliana naturales descrito previamente 6. Nos racionalmente rediseñado la secuencia de ARNm de salir de los sitios de empalme naturales solo, pero colocamos secuencias que codifican cloroplasto-o etiquetas al peroxisoma dentro de los intrones empalmados alternativamente-(Figura 1). La proteína expresada puede o no puede tener una etiqueta, dependiendo de si la pre-ARNm que lo codifica se escindió como un intrón (Figuras 1g y 1h). Para obtener más información sobre el diseño de las construcciones que se presentan en este trabajo, por favor vea el artículo del compañero 11.
Debido a que este es todavía un esfuerzo significativo clonación, montaje Gibson, un nuevo método para la clonación de las construcciones de ADN, es used en la construcción. El método de Gibson puede ser utilizado para cualquier secuencia, con independencia de los sitios de restricción (Figura 2) 12-14. La mezcla específica de enzimas permite un solo paso, el montaje isotérmica. En este método, varias partes de ADN lineal de doble cadena están diseñados de tal manera que tienen secuencias solapantes de ~ 50 pb. El conjunto de mezcla de enzimas Gibson digiere parcialmente las partes lineales de ADN, la exposición de cadenas simples de secuencias homólogas. Estas secuencias de una sola hebra parciales se vuelven a recocidas en la mezcla de reacción, lo que resulta en una, de un solo paso, independiente de la secuencia, la reacción subclonación-ligadura libre rápida.
Este trabajo describe 1) Diseño de construcciones racionales empalmados alternativamente para la expresión en los cloroplastos de las plantas, los peroxisomas, y citosoles, 2) su clonación utilizando el nuevo método de ligadura libre de reunión Gibson, 3) de su entrega a las células de las hojas de tabaco con la pistola de genes, y 4) resultados que muestran la orientación de orgánulos, como se observa con las buenas prácticas agrariasy microscopía confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se describen estrategias simples para la localización de una única proteína transgénica a múltiples compartimentos celulares en plantas. El objetivo era diseñar constructo que expresara un solo gen en más de un orgánulo en Nicotiana benthamiana. Las estrategias incluyen el diseño racional de construcciones de ADN basada en GFP, el montaje de Gibson, la entrega de los plásmidos de células de las hojas con la pistola de genes, y la observación de los resultados con microscopía confoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Jen Sheen, del Hospital General de Massachusetts por la generosa donación de plantones Nicotiana benthamiana. Jen Bush nos ayudó mucho en el asesoramiento en el cultivo de plantas y la creación de un área de la cámara de crecimiento. Tom Ferrante del Instituto Wyss ofreció ayuda decisiva con microscopía confocal. Los autores desean agradecer especialmente a Don Ingber del Hospital de Niños de Boston y el Instituto Wyss por la generosa donación de una pistola de genes y materiales asociados. Los fondos para este proyecto fueron proporcionados a través de un acuerdo de cooperación con el Departamento de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Energía (ARPA-E Award # DE-000079) para PAS, JCW, y Médicos del Mundo, y por medio de Chimerion Biotechnology, Inc. para MJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
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