Summary

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

Published: April 18, 2014
doi:

Summary

Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.

Abstract

Birden fazla alt-hücresel organellere tek bir hedef protein için, bitkiler tipik olarak, ilgili genleri çoğaltmak ve diferansiyel promoterler ve / veya sinyal sekansları da dahil olmak üzere karmaşık bir düzenleyici stratejiler kullanılarak ayrı ayrı her bir geni ifade eder. Metabolik mühendisleri ve belirli bir organele hedef enzimlerin ilgilenen sentetik biyologlar bir meydan okuma ile karşı karşıyayız: Birden fazla organele lokalize olan bir protein için, mühendis aynı gen birden çok kez klonlamak gerekir. Bu çalışma bu strateji için bir çözüm sunar: mRNA alternatif kırpılmayı sokmak. Bu teknoloji kurulmuş ve peroksizom kloroplast hedefleme dizilerinin yararlanır ve alternatif olarak eklenmiş bir tek mRNA halinde birleştirir. Bazı ek yeri varyantları sitoplazmada peroksisom bazı ve bazı, kloroplast gönderilir. Burada sistem çoklu-organel alternatif eklenmeye hedefleme için tasarlanmıştır. Bu çalışmada, GFP ifade olması bekleniyordurasyonel şekilde tasarlanan 5 'mRNA etiketleri bir dizi kloroplast, sitosol ve peroksisom olarak işlenene. Bu etiketler, heterolog genler, birden çok alt-hücresel organellerde ifade edilmesi gerektiğinde gerekli klonlama miktarını azaltma potansiyeline sahiptir. Bu yapılar önceki çalışmada 11 olarak tasarlanmıştır ve Gibson montaj, kısıtlama enzimleri gerektirmeyen bir ligasyon bağımsız klonlama yöntemiyle klonlanmıştır. Elde edilen plazmidler, bir modifiye protokol ile Gen Tabancası Nicotiana benthamiana yaprak epidermal hücrelere dahil edilmiştir. Son olarak, transforme edilmiş yapraklar konfokal mikroskopi ile gözlemlenmiştir.

Introduction

Bu çalışma, bitki hücrelerinin çok organellerde bir raportör proteini ifade etmek için, ancak yalnızca tek bir DNA yapısı ile, burada bir metabolik mühendislik / sentetik biyoloji projedir.

Birden fazla konuma proteinleri hedef için bir yaklaşım, çok sayıda klonlama genetik kopya, farklı bir lokalizasyon peptit içeren her içerir. Her kopya tek dönüşümleri 1 çaprazlanması ile, alternatif olarak ardışık yeniden dönüştürülmesinin tarafından tanıtılan, ya da olmalıdır. Bu ek klonlama içerir ve terminaline başına bir lokalizasyon etiketi ile sınırlıdır.

Birden fazla yere lokalize protein için başka bir alternatif birleştirme 2-5 geçer. RNA, tek bir genden transkribe edilen, ancak transkriptinin farklı numaralar hücre başına birden fazla şekilde genellikle, farklı işlenir. Bu, tek bir genden transkribe hücreye birden fazla haberci RNA neden olabilir. Bu farklı Messenger RNA, aynı proteinin farklı izoformları için kodlayan, ya da bir çerçeve kayması, tamamen farklı bir protein halinde olabilir. Alternatif yapıştırma yıllardır literatürde tarif edilmiş olmasına rağmen, etki ve korunmuş verici ve alıcı ekleme sitelerinin mekanizmaları sadece daha yakın 6 açıklanacaktır edilmektedir. Bu siteleri daha iyi tarif ediliyor, onlar mühendislik için fırsatlar açmak.

Birden organellerde bir proteini ifade ederken bitki metabolik mühendisleri bir meydan okuma ile karşı karşıyayız. Birden fazla organele lokalize olan bir protein için, mühendis ilgi organele yönlendirerek, ayrı bir sinyal sekansı ile aynı gen, her birden çok kez klonlanması gerekir. Üç organellerde tek bir gen için, bu sadece üç genlerdir. Ancak altı gen metabolik yolu için, bu 18 gen, önemli bir çaba klonlama için genişler. Tek alternatif dilinmemiş gen işareti içine birden yerelleştirme dizileri birleştirerekificantly bu çaba azaltır. Örneğin, yeniden mühendislik fotorespirasyon 7,8 ve izoprenoid sentez 9,10 kloroplast ve peroksizomları hem de içerir. Doğal Arabidopsis thaliana sisteminde görüldüğü gibi bizim durumumuzda biz daha önce 6 tarif ekleme sitelerin yararlandı. Bu rasyonel tek başına doğal ek yeri siteleri ayrılan mRNA sekansı yeniden, ancak alternatif olarak eklenmiş-intron (Şekil 1) içinde ya da kloroplast-hedefleme peroksizom etiketler kodlayan dizileri yerleştirilmiş olur. Ifade edilen protein ya da kodlanan pre-mRNA, bir intron (Şekil 1G ve 1 H) olarak eksize edildi bağlı olarak, bir etiket olabilir veya olmayabilir. Bu çalışmada sunulan yapıların tasarımı hakkında daha fazla bilgi için, arkadaşı makale 11 bakın lütfen.

Bu hala önemli bir klonlama çaba, Gibson montaj, DNA yapıları klonlama için yeni bir yöntem olduğundan, uinşaat sed. Gibson yöntem ne olursa olsun, kısıtlama siteleri (Şekil 2), 12-14 arasında, herhangi bir sıra için kullanılabilmektedir. Enzimlerin spesifik karışımı, tek aşamalı, izotermal montaj sağlar. Bu yöntemde, çok sayıda çift kollu lineer DNA parçaları, 50 bp ~ örtüşen dizilerine sahip olacak şekilde tasarlanmıştır. Gibson düzeneği enzim karışımı kısmen homolog dizilerin tek kollu maruz bırakılması, lineer DNA parçaları sindirir. Bu kısmi tek sarmallı diziler, hızlı, tek aşamalı, dizi-bağımsız, ligasyon içermeyen alt klonlama reaksiyonu ile sonuçlanan reaksiyon karışımı içinde yeniden tavlanır.

Bu çalışma bitki kloroplast, peroksisomlara ve sitosollerde ifade için 1) rasyonel tasarım, alternatif olarak eklenmiş yapıları açıklar, 2) kendi klonlama Gibson meclisin yeni ligasyonu-free yöntemi kullanılarak, 3) Gen Tabancası ile tütün yaprak hücrelerinin içine teslimat ve GFP ile gözlemlendiği üzere, organel hedefleme arası 4) Sonuçve konfokal mikroskopi.

Protocol

Hedefleme Çoklu organel için alternatif olarak eklenmiş diziler-1. Design Nihai protein ifadesi için siteler belirler. Bu iş için, faiz kloroplast, peroksisom ve sitosola hedefleme olduğunu. Ilgi organellere proteinleri hedef bilinen protein ve DNA dizilerini tanımlamak için literatür kullanın. Bu durumda, bir kloroplast Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferaz 6,15 ikinci hedef sekansı ve Arabidopsis thaliana transtiretin gibi S-a…

Representative Results

Tasarım çaba önemli bir planlama sonucudur. Bu proje için yeni diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin çevrilmiş bir ön-mRNA'nın alternatif uç uca eklenmesi oluşturmak için kullanılmasıdır. Bu proteinler, bu durumda, farklı organeller olarak ifade edilmiştir kloroplast, peroksizom ve / veya Sitosol. Bu alternatif olarak 6 eklenmiş doğal Arabidopsis geni uyarlanmış ve (TriTag-1 ve TriTag-2) alternatif olarak ekson dizileri hedef kloroplast 6 ve peroksizom …

Discussion

Bu çalışmada, basit yöntemler bitkilerde çok sayıda hücresel bölümlerin, tek bir transgenik proteini lokalize için tarif edilmiştir. Amaç, Nicotiana benthamiana birden fazla organelde tek bir gen ifade edecek bir yapı tasarlamaktı. Rasyonel stratejiler GFP bazlı DNA konstruktlarının tasarımı, Gibson montaj, Gene Gun yaprak hücrelere plasmidlerin teslimat ve konfokal mikroskobu ile sonuçların gözlenmesi bulunur.

Üç farklı kısa, N-terminal etiketler 11<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Nicotiana benthamiana fidan cömert bağış için Massachusetts Genel Hastanesi Jen Sheen teşekkür etmek istiyorum. Jen Bush bitkilerin büyüyen ve büyüme odası alanı kurma tavsiyesi bize büyük ölçüde yardımcı oldu. Wyss Enstitüsü'nden Tom Ferrante konfokal mikroskobu ile çok önemli yardım teklif etti. Yazarlar, özellikle Boston Çocuk Hastanesi'nden Don Ingber ve Gen Tabancası ve ilgili malzemeleri cömert bağış için Wyss Enstitüsü'ne teşekkür etmek istiyorum. Bu proje için finansman PAS, JCW, ve MDM Enerji İleri Araştırma Projeleri Ajansı Başkanlığı (ARPA-E Ödül # DE-000079) ile bir işbirliği anlaşması ile sağlanan ve Chimerion Biyoteknoloji, Inc aracılığıyla MJV için yapıldı.

Materials

Oligonucleotide primers IDT (custom) Design specifically for construct
GeneBlocks IDT (custom) 500 bp oligonucleotides
ApE software U Utah (download) http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit Qiagen 28004 Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit Qiagen 27104 Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer NEB M0532S Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix NEB E2611L Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5 Teknova T1075 Gibson assembly mix
1 M MgCl2 G Biosiences 82023-086 Gibson assembly mix
dNTP mix Fermentas R0192 Gibson assembly mix
1 M DTT Fermentas R0861 Gibson assembly mix
PEG-8000 Affymetrix 19966 Gibson assembly mix
NAD Applichem A1124,0005 Gibson assembly mix
T5 exonuclease Epicentre T5E4111K Gibson assembly mix
Phusion polymerase NEB F530S Gibson assembly mix
Taq DNA ligase NEB M0208L Gibson assembly mix
Gibthon.org Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit Qiagen 12963 Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system BioRad 165-2451 Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana (n/a) (n/a) Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope Leica SP5 X MP Imaging of resultant cells
Deep well slides Electron Microscopy Sciences 71561-01 Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

References

  1. Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
  2. Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
  3. Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
  4. Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants – coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
  5. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
  6. Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5′- and 3′-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
  7. Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
  8. Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
  9. Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
  10. Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
  11. Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5′ mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
  12. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  13. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
  14. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  15. Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
  16. Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
  17. Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
  18. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  19. Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
  20. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).

Play Video

Cite This Article
Mattozzi, M. D., Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C. Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun. J. Vis. Exp. (86), e51234, doi:10.3791/51234 (2014).

View Video