Ligatable Floresan Sondalar Deneysel İnme Hücre Ölümü Fagositik Gümrükleme Değerlendirilmesi
Summary
Biz aktif fagositik hücrelerin yerinde etiketleme seçici için yeni bir floresan tekniği sunmak, hangi berrak inme hücre cesetlerin kapalı. İskemik beyin içinde mevcut olan fagositoz sadece küçük bir kısmı, hücre ölümü açıklık katılmak için bir yaklaşım, iskemi, beyin reaksiyon değerlendirilmesi için önemlidir.
Abstract
Biz fokal beyin iskemi fagositik açıklık görselleştirme için yeni bir histokimyasal yaklaşım açıklar. Yaklaşım herhangi bir hücresel soy atık yönetimi fagositlerce inme ölü hücrelerin ortadan kaldırılması çalışmasına izin verir. Fagositoz yeteneğine sahip, farklı kökenlerden çok sayıda hücreleri iskemik beyinde mevcut olmasına rağmen, bunların sadece bir kısmı aktif olarak yutan ve hücre cesetleri sindirmek. Seçici görselleştirme, ölçme ve böyle aktif fagositik atık yönetiminin analizi iskemi beyin yanıtı değerlendirirken yardımcı olur. Bu daha sonraki işlemleri için rejeneratif yol açar gibi etkili hücre ölümü açıklık, iskemik yaralanma beyin kurtarma için önemlidir. Cesetleri temizlemek için arıza olmayan bozulmuş DNA ve protein neden olduğu zehirli bir reaksiyona neden olur. Tarif edilen işlem, seçici yutulma sırasında tüm fagositler üretilen karakteristik DNA sonları için bir viral topoizomeraz ile lige floresan probları kullanırve hücrelerin sindirim geri dönüşümsüz iskemi zarar. Yöntem, iskemik yaralanma beyin reaksiyon soruşturma için yeni bir araçtır.
Introduction
İskemik inme etkilenen beyin dokusunda köklü değişiklikleri neden olur. Bu mikroglial kaynaklı yerleşik fagositik hücrelerin hızlı aktivasyonuna yol açar ki, büyük hücre ölümü başlatır. Aynı zamanda, nötrofiller, makrofajlar, dendritik ve mast hücreleri dahil olmak üzere, 1,2 kandan alınan profesyonel fagositlerin çeşitli iskemik beyin infiltrasyonu yola çıkıyor.
Hala iskemik yaralanma bu yanıtı olumlu ya da olumsuz bir rolü olup olmadığını tartışmalıdır. Ölü hücreleri temizler ve enflamasyon bastırır felç nedeniyle aşağıdaki fagositoz yararlı olabilir, ancak, aynı zamanda, nöronun hayatta kalışını etkileyen ve doku hasarı 1-5 arttıran toksik reaktif oksijen türleri oluşturur.
Fagositik hücrelerin çeşitli iskemik beyin sızmak da, tüm bunların hücre cesetlerini içine çeken ve rejeneratif süreçleri 1-3 önünü temizleyerek atık yönetimine katılmak. Bu crinme hücre ölümünün fagositik açıklık gerçekleştirmek atık yönetim hücrelerinin seçici tanımlanması için bir gereklilik eates. Gibi aktif atık yönetimi hücreleri görüntüleme, onlar sardı hücre cesetleri aşağılamak ne kadar verimli soruyu cevaplamak için de önemlidir. Kendi kendine bağışıklık ve patolojik nükleer malzeme 6'nın serbest önler, çünkü fagositozu ölen hücrenin DNA etkin ve tam bozulması gereklidir.
Burada aktif fagositik hücrelerin belirteçleri olarak spesifik DNA sonlarını kullanmak yeni araştırmalar mevcut. Bu imza sonları sadece işlevsel bir atık yönetimi hücrelerin içinde yuttu çekirdeklerinin parçalanması sırasında üretilir. Bu nedenle sondalar seçici yutmak sadece bu fagositler etiket ve aktif hücresel cesetleri sindirmek. Ayrıca yutulma sonrası yoğunluğu ve DNA parçalanması tamamlanmasını gözlem izin verir. Problar yoğunluğu ve effici değerlendirmeler de faydalıdırfagositik açıklık ency.
Yeni sondalar olmayan bir protein bazlı işaretleyici kullanan ve bu nedenle geniş bir iskemik hasar hücre morfolojisi bozacak ya da özellikle çekirdek iskemik bölge içinde, protein-bazlı belirteçler tüketebilir inme, çalışmalarda özellikle avantajlı olabilir.
Tekniğin ilkesi, Şekil 1 'de sunulmuştur. Şekil enzim vaccinia topoizomeraz (VACC TOPO) ile lige saç tokası şeklinde oligonükleotit probları gösterir 5'OH DNA DNA sindirim 7 boyunca lızozomal DNase II tarafından üretilen sona erer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu videoda fokal beyin iskemi hangi berrak hücre ölümü aktif fagositler etiketlemek için nasıl, doku kesiti biçiminde göstermektedir. Sunulan tekniği özellikle yuttu ve aktif hücresel cesetleri sindirimi yalnızca bu atık yönetimi hücreleri etiketler ilk yaklaşımdır. Bu, bu yeteneğe sahip değilsiniz fagositik hücrelerin, etiketlenmesi için varolan diğer yöntemlere göre avantajlı kılar.
, Çift kollu bir sardı çekirdeklerin sindirim sırasında atık yönetim hücr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Nörolojik Bozukluklar Ulusal Enstitüsü hibe R01NS062842 ve Sağlık (VVD) İnme, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve ARRA aracılığıyla Sağlık İnme, National Institutes (VVD) ve R21 hibe R21 NS064403 tarafından desteklenmiştir Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik EB006301 Ulusal Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
