Het beoordelen Fagocytische Ontruiming van celdood in Experimental Stroke door ligeerbare fluorescerende probes
Summary
We presenteren een nieuw fluorescentie techniek voor het selectief in situ labeling van actieve fagocyterende cellen, die duidelijk uit cel lijken in een beroerte. De aanpak is van belang voor de beoordeling hersenen reactie op ischemie omdat slechts een klein deel van fagocyten aanwezig in ischemische hersenen deelnemen klaring van celdood.
Abstract
We beschrijven een nieuwe histochemische aanpak voor visualisatie van fagocyterende klaring bij focale ischemie hersenen. De aanpak maakt de studie van de eliminatie van dode cellen in slag door afval-beheer fagocyten van een mobiele lijn. Hoewel een groot aantal cellen van verschillende oorsprong die in staat fagocytose aanwezig in ischemische hersenen, slechts een deel daarvan actief overspoelen en verteren cellen lijken. De selectieve visualisatie, kwantificering en analyse van dergelijke actieve fagocytaire afval-management zijn nuttig bij het beoordelen van de hersenen reactie op ischemie. Efficiënte celdood klaring is belangrijk voor de hersenen herstel van ischemische schade, want het opent de weg voor de latere regeneratieve processen. De niet lijken reinigen zou resulteren in een toxische reactie veroorzaakt door niet-afgebroken DNA en eiwitten. De beschreven procedure wordt fluorescente probes selectief geligeerd door een virale topoisomerase karakteristieke DNA-breuken die in alle fagocyten tijdens afblazenen digestie van cellen onherstelbaar beschadigd door ischemie. De methode is een nieuw instrument voor het onderzoeken van hersenen reactie op ischemie.
Introduction
Ischemische beroerte veroorzaakt diepgaande veranderingen in de getroffen hersenweefsel. Het initieert massale celdood, hetgeen leidt tot een snelle activering van inwoner fagocytische cellen van microgliale oorsprong. Ook worden af infiltratie van ischemische hersenen door verschillende soorten op basis van bloed professionele fagocyten waaronder neutrofielen, macrofagen, dendritische, en mestcellen 1,2.
Het wordt nog steeds gediscussieerd of deze reactie op ischemische schade speelt een positieve of een negatieve rol. Hoewel fagocytose na slag voordelig kan zijn omdat het ruimt dode cellen en onderdrukt ontstekingen, het genereert ook toxische zuurstofradicalen die neuronale overleving en verergeren weefselschade 1-5.
Terwijl verschillende soorten fagocytcellen infiltreren ischemische hersenen, niet allemaal deelnemen aan afval-beheer door engulfing cel lijken en de weg vrijmaken voor regeneratieve processen 1-3. Deze creates een vereiste voor selectieve identificatie van afvalbeheer cellen die het uitvoeren van fagocytische klaring van celdood in een beroerte. Wanneer de beeldvorming dergelijke actieve afvalbeheer cellen, is het ook belangrijk om de vraag hoe efficiënt ze degraderen de verzwolgen cel lijken te beantwoorden. De efficiënte en volledige afbraak van DNA de stervende cel in fagocytose is essentieel omdat het voorkomt zelf-immunisatie en het vrijkomen van pathologische kernmateriaal 6.
Hier presenteren we nieuwe probes die specifiek DNA breuken als merkers van actieve fagocyten. Deze handtekening pauzes zijn uitsluitend geproduceerd tijdens afbraak van verzwolgen kernen binnen functionele afvalbeheer cellen. Daarom is de sondes selectief alleen die fagocyten die overspoelen label en actief te verteren cellulaire lijken. Zij laten ook het observeren van de intensiteit en de voltooiing van DNA afbraak na het afblazen. De sondes zijn nuttig in evaluaties van intensiteit en efficirantie van fagocytaire klaring.
De nieuwe probes steunen op een niet-eiwit-gebaseerde merker en kan daarom bijzonder voordelig zijn in studies van slag waarbij grote ischemische celmorfologie kunnen verstoren of afbreken van eiwitten merkers, vooral in de kern ischemische zone.
Het principe van de techniek is weergegeven in figuur 1. Figuur toont haarspeldvormige oligonucleotideprobes geligeerd door het enzym topoisomerase vaccinia (VACC TOPO) om 5'OH DNA-uiteinden gegenereerd door lysosomale DNase II in DNA digestie 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze video laten we zien, in het weefsel sectie-indeling, hoe actief fagocyten etiket waarop duidelijk celdood bij focale ischemie hersenen. De gepresenteerde techniek is de eerste benadering die specifiek labels alleen die afvalbeheer cellen die overspoeld en actief te verteren cellulaire lijken. Dit maakt het voordeel ten opzichte van andere bestaande werkwijzen voor het labelen van fagocyterende cellen, die deze mogelijkheid hebben.
De methode maakt gebruik van een algemene en selectie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidie R01NS062842 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke, National Institutes of Health (VVD) en door subsidies R21 NS064403 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke, National Institutes of Health door ARRA (VVD) en R21 EB006301 Nationaal Instituut voor Biomedische Weergave en Biotechniek, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
