Évaluation phagocytaire Liquidation de la mort cellulaire dans des maladies expérimentale par ligaturables fluorescentes sondes
Summary
Nous présentons une nouvelle technique de fluorescence pour le marquage sélectif in situ des cellules phagocytaires actives dans, qui clairement de cadavres de cellules dans la course. L'approche est importante pour évaluer la réaction de l'ischémie cérébrale, car seule une faible proportion des phagocytes présents dans le cerveau ischémique participer à la clairance de la mort cellulaire.
Abstract
Nous décrivons une nouvelle approche histochimique pour la visualisation de la clairance phagocytaire dans l'ischémie cérébrale focale. L'approche permet l'étude de l'élimination des cellules mortes en course par les phagocytes de gestion des déchets de toute lignée cellulaire. Bien que de nombreuses cellules d'origines différentes qui sont capables de phagocytose sont présents dans le cerveau ischémique, une partie seulement d'entre eux engloutir activement et digérer corps cellulaires. La visualisation sélective, la quantification et l'analyse de cette gestion des déchets phagocytaire actif sont utiles pour évaluer la réponse du cerveau à l'ischémie. Clairance de la mort cellulaire efficace est important pour la guérison du cerveau de la lésion ischémique, car elle ouvre la voie à des processus de régénération ultérieures. L'échec de nettoyer les cadavres se traduirait par une réaction toxique causée par l'ADN et les protéines non dégradées. La procédure décrite utilise des sondes fluorescentes ligaturées sélectivement par une topoisomérase virale à des ruptures d'ADN caractéristiques produites dans tous les phagocytes pendant engloutissementet la digestion des cellules irrémédiablement endommagée par l'ischémie. La méthode est un nouvel outil pour l'étude de la réaction du cerveau à une lésion ischémique.
Introduction
L'AVC ischémique induit de profonds changements dans les tissus du cerveau touchée. Il initie une mort cellulaire massive, ce qui conduit à l'activation rapide des cellules phagocytaires d'origine résidentes microgliale. Elle définit également hors de l'infiltration cérébrale ischémique par divers types de phagocytes professionnels dérivés du sang, y compris les neutrophiles, les macrophages, dendritique, et les mastocytes 1,2.
Il est encore débattue de savoir si cette réponse à une lésion ischémique joue un un rôle positif ou négatif. Bien que la phagocytose après un AVC peut être bénéfique, car elle efface les cellules mortes et supprime l'inflammation, il génère également des espèces réactives de l'oxygène toxiques affectant la survie neuronale et aggravant des lésions tissulaires 1-5.
Bien que plusieurs types de cellules phagocytaires infiltrent cérébrale ischémique, participent pas tous à la gestion des déchets par engloutissant des cadavres cellulaires et ouvrant la voie à des processus de régénération 1-3. Cette creates une exigence pour l'identification sélective des cellules de gestion des déchets qui effectuent jeu phagocytaire de la mort cellulaire dans la course. Quand l'imagerie de telles cellules de gestion des déchets actifs, il est également important de répondre à la question de savoir comment ils se dégradent efficacement les cadavres de cellules englouti. La dégradation effective et complète de l'ADN de la cellule de mourir dans la phagocytose est essentielle car elle empêche l'auto-immunisation et la libération de matières nucléaires pathologique 6.
Ici, nous présentons de nouvelles sondes qui utilisent des cassures d'ADN spécifiques comme marqueurs de cellules phagocytaires actifs. Ces pauses de signature sont fabriquées exclusivement en cas de panne de noyaux englouti l'intérieur des cellules de gestion des déchets fonctionnels. Par conséquent, les sondes étiquette sélectivement que les phagocytes qui engloutissent et digèrent activement cadavres cellulaires. Ils permettent également observer l'intensité et l'achèvement de la rupture d'ADN après le engloutissement. Les sondes sont utiles dans l'évaluation de l'intensité et efficirence de jeu phagocytaire.
Les nouvelles sondes reposent sur un marqueur non-protéique base et peuvent donc être particulièrement avantageux dans les études de course, où des dommages ischémique peut perturber la morphologie cellulaire ou épuiser marqueurs à base de protéines, en particulier dans la zone ischémique noyau.
Le principe de la technique est présenté dans la figure 1. La figure montre des sondes oligonucléotidiques en forme d'épingle à cheveux ligaturées par l'enzyme topoisomérase de la vaccine (VACC TOPO) OH en 5 'de l'ADN à extrémités générées par lysosomale DNase II pendant la digestion de l'ADN 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette vidéo, nous démontrons, dans le format de coupe de tissu, la façon d'étiqueter les phagocytes actifs dont la mort cellulaire claire dans l'ischémie cérébrale focale. La technique présentée est la première approche qui marque spécifiquement que les cellules de gestion des déchets qui ont englouti et digérer activement cadavres cellulaires. Il est donc avantageux par rapport à d'autres méthodes existantes pour le marquage de cellules phagocytaires, qui ne possèdent pas cette capacit?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par la subvention R01NS062842 de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies, National Institutes of Health (VVD) et par des subventions R21 NS064403 de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies, les Instituts nationaux de la santé à travers l'ARRA (VVD) et R21 EB006301 Institut national d'imagerie biomédicale et bio-ingénierie, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
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- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
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