Ligatable फ्लोरोसेंट जांच से प्रायोगिक स्ट्रोक में कोशिका मृत्यु का phagocytic क्लीयरेंस का आकलन
Summary
हम सक्रिय phagocytic कोशिकाओं की सीटू लेबलिंग में चयनात्मक के लिए एक नया प्रतिदीप्ति तकनीक मौजूद है, जो स्पष्ट स्ट्रोक में सेल लाशों बंद. इस्कीमिक मस्तिष्क में मौजूद फ़ैगोसाइट के केवल एक छोटे से अनुपात कोशिका मृत्यु की निकासी में भाग लेने क्योंकि दृष्टिकोण ischemia के मस्तिष्क की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
Abstract
हम फोकल मस्तिष्क ischemia में phagocytic निकासी के दृश्य के लिए एक नया histochemical दृष्टिकोण का वर्णन. दृष्टिकोण किसी भी सेलुलर वंश का अपशिष्ट प्रबंधन फ़ैगोसाइट द्वारा स्ट्रोक में मृत कोशिकाओं के उन्मूलन का अध्ययन परमिट. Phagocytosis में सक्षम हैं कि अलग मूल के कई कक्षों इस्कीमिक मस्तिष्क में मौजूद हैं, उनमें से केवल हिस्सा सक्रिय रूप से अपनी चपेट में ले और सेल लाशों को पचाने. चुनिंदा दृश्य, मात्रा का ठहराव और इस तरह सक्रिय phagocytic अपशिष्ट प्रबंधन के विश्लेषण ischemia के मस्तिष्क की प्रतिक्रिया का आकलन करने में सहायक होते हैं. यह बाद में पुनर्योजी प्रक्रियाओं के लिए रास्ता खुल जाता है के रूप में कुशल कोशिका मृत्यु निकासी, इस्कीमिक चोट से मस्तिष्क वसूली के लिए महत्वपूर्ण है. लाशों को साफ करने के लिए विफलता गैर अपमानित डीएनए और प्रोटीन की वजह से एक जहरीले प्रतिक्रिया नतीजा होगा. वर्णित प्रक्रिया चुनिंदा घिराव के दौरान सभी फ़ैगोसाइट में उत्पादित विशेषता डीएनए टूट के लिए एक वायरल topoisomerase द्वारा ligated फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करता हैऔर कोशिकाओं की पाचन अचल ischemia से क्षतिग्रस्त. विधि इस्कीमिक चोट करने के लिए मस्तिष्क की प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक नया उपकरण है.
Introduction
इस्कीमिक स्ट्रोक प्रभावित मस्तिष्क के ऊतकों में गहरा परिवर्तन लाती है. यह microglial मूल के निवासी phagocytic कोशिकाओं का तेजी से सक्रियण की ओर जाता है, जो बड़े पैमाने पर सेल मृत्यु शुरू. यह भी neutrophils, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान है, और मस्तूल कोशिकाओं 1,2 सहित रक्त प्राप्त पेशेवर फ़ैगोसाइट के विभिन्न प्रकार से इस्कीमिक मस्तिष्क की घुसपैठ बंद सेट.
यह अभी भी इस्कीमिक चोट करने के लिए इस प्रतिक्रिया एक सकारात्मक या नकारात्मक भूमिका निभाता है बहस हो रही है. यह मृत कोशिकाओं को साफ करता है और सूजन को दबा क्योंकि स्ट्रोक के बाद phagocytosis फायदेमंद हो सकता है, यह भी neuronal अस्तित्व को प्रभावित करने और ऊतकों को नुकसान 1-5 exacerbating विषाक्त प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों उत्पन्न करता है.
Phagocytic कोशिकाओं के कई प्रकार के इस्कीमिक मस्तिष्क में घुसपैठ करते हैं, उन सभी को नहीं सेल लाशों छा और पुनर्योजी प्रक्रियाओं 1-3 के लिए रास्ता साफ़ करके अपशिष्ट प्रबंधन में भाग लेते हैं. यह करोड़स्ट्रोक में कोशिका मृत्यु का phagocytic निकासी के लिए बाहर ले कि अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं के चुनिंदा पहचान के लिए एक आवश्यकता eates. ऐसे सक्रिय अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं जब इमेजिंग, यह वे घिरा सेल लाशों नीचा कैसे कुशलतापूर्वक के सवाल का जवाब देना भी जरूरी है. यह आत्म – प्रतिरक्षण और रोग परमाणु सामग्री 6 की रिहाई से बचाता है क्योंकि phagocytosis में मरने कोशिका के डीएनए की प्रभावी और पूरा गिरावट आवश्यक है.
यहाँ हम सक्रिय phagocytic कोशिकाओं के मार्कर के रूप में विशिष्ट डीएनए टूट का उपयोग करने वाले नए जांच उपस्थित थे. ये हस्ताक्षर टूट जाता है विशेष रूप से कार्यात्मक अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं के अंदर घिरा नाभिक के टूटने के दौरान उत्पादन किया जाता है. इसलिए जांच चुनिंदा चपेट में ले कि केवल उन फ़ैगोसाइट लेबल और सक्रिय सेलुलर लाशों को पचाने. उन्होंने यह भी घिराव के बाद तीव्रता और डीएनए टूटने के पूरा होने के अवलोकन की अनुमति. जांच तीव्रता और effici के मूल्यांकन में सहायक होते हैंphagocytic निकासी की ency.
नई जांच एक गैर प्रोटीन आधारित मार्कर पर भरोसा करते हैं और इसलिए व्यापक इस्कीमिक क्षति सेलुलर आकारिकी बाधित या विशेष रूप से कोर इस्कीमिक क्षेत्र के अंदर, प्रोटीन आधारित मार्करों खलाना कर सकते हैं जहां स्ट्रोक, के अध्ययन में विशेष रूप से लाभप्रद हो सकता है.
तकनीक के सिद्धांत चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. चित्रा एंजाइम चेचक topoisomerase (Vacc TOPO) द्वारा ligated बाल के लिये कांटा के आकार oligonucleotide जांच से पता चलता है 5'OH डीएनए को पाचन के दौरान 7 lysosomal DNase द्वितीय द्वारा उत्पन्न होता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस वीडियो में हम फोकल मस्तिष्क ischemia में जो स्पष्ट कोशिका मृत्यु सक्रिय फ़ैगोसाइट लेबल करने के लिए कैसे, ऊतक अनुभाग प्रारूप में, प्रदर्शित करता है. प्रस्तुत तकनीक विशेष रूप से घिरा हुआ है और सक्रिय सेलुल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान R01NS062842 और स्वास्थ्य (VVD) के स्ट्रोक, राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा और मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और ARRA के माध्यम से स्वास्थ्य के स्ट्रोक, राष्ट्रीय संस्थान (VVD) और R21 से अनुदान R21 NS064403 द्वारा समर्थित किया गया बायोमेडिकल इमेजिंग और बायोइन्जिनियरिंग EB006301 राष्ट्रीय संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
