Valutare Liquidazione fagocitaria della morte cellulare in corsa sperimentale da Ligatable Fluorescent Probes
Summary
Vi presentiamo una nuova tecnica di fluorescenza per l'etichettatura selettiva in situ di fagociti attivi, che chiaramente fuori cadaveri cellulari in corsa. L'approccio è importante per valutare la reazione di ischemia cerebrale perché solo una piccola parte dei fagociti presenti nel cervello ischemico partecipare nella clearance di cellule morte.
Abstract
Descriviamo un nuovo approccio istochimica per la visualizzazione della clearance fagocitica in ischemia cerebrale focale. L'approccio consente lo studio di eliminazione delle cellule morte in corsa dai fagociti di gestione dei rifiuti di qualsiasi lignaggio cellulare. Sebbene numerose cellule di origine diversa che sono capaci di fagocitosi sono presenti nel cervello ischemico, solo una parte di essi attivamente fagocitare e digerire corpi cellulari. La visualizzazione selettiva, quantificazione e analisi di tali attività di gestione dei rifiuti fagocitica sono utili nella valutazione della risposta del cervello ad ischemia. Efficiente liquidazione morte cellulare è importante per il recupero cervello dalla lesione ischemica, in quanto apre la strada per i successivi processi rigenerativi. La mancata pulizia cadaveri comporterebbe una reazione tossica causata da DNA non degradato e proteine. La procedura descritta utilizza sonde fluorescenti selettivamente legatura da un topoisomerasi virale di caratteristici rotture del DNA prodotte in tutti i fagociti durante la fagocitazionee la digestione delle cellule irreversibilmente danneggiato da ischemia. Il metodo è un nuovo strumento per lo studio della reazione del cervello al danno ischemico.
Introduction
Ictus ischemico induce profondi cambiamenti nel tessuto cerebrale colpito. Si avvia morte cellulare massiccia, che porta alla rapida attivazione delle cellule fagocitiche residenti di origine microglia. Essa stabilisce inoltre off infiltrazione di cervello ischemico da vari tipi di fagociti professionali emoderivati compresi neutrofili, macrofagi, dendritiche e mastociti 1,2.
E 'ancora in discussione se questa risposta al danno ischemico svolge un positivo o un ruolo negativo. Anche se la fagocitosi dopo l'ictus può essere utile perché elimina le cellule morte e sopprime l'infiammazione, ma genera anche tossici specie reattive dell'ossigeno che influenzano la sopravvivenza neuronale e aggravando il danno tissutale 1-5.
Mentre diversi tipi di fagociti infiltrano cerebrale ischemico, non tutti partecipano in-gestione dei rifiuti inglobando cadaveri delle cellule e aprendo la strada a processi rigenerativi 1-3. Questo creates un requisito per l'identificazione selettiva delle cellule di gestione dei rifiuti che effettuano la clearance fagocitica della morte cellulare in corsa. Quando l'imaging tali cellule di gestione dei rifiuti attivi, è importante anche per rispondere alla domanda di come efficacemente si degradano i cadaveri delle cellule inghiottito. Il degrado efficace e completa del DNA della cellula morente nella fagocitosi è essenziale perché evita l'auto-immunizzazione e il rilascio di materiale nucleare patologico 6.
Qui vi presentiamo nuove sonde che utilizzano specifici rotture del DNA come marcatori di fagociti attivi. Queste interruzioni di firma sono prodotti esclusivamente durante la composizione dei nuclei inghiottito dentro le celle di gestione dei rifiuti funzionale. Pertanto, le sonde selettivamente etichetta solo i fagociti che tracimano e digeriscono attivamente cadaveri cellulari. Essi permettono anche osservando l'intensità e completamento di ripartizione DNA dopo la engulfment. Le sonde sono utili nelle valutazioni di intensità e efficirenza della clearance fagocitica.
Le nuove sonde basano su un marcatore non proteico-based e quindi può essere particolarmente vantaggiosa in studi di ictus, quali un'intensa danno ischemico può interrompere morfologia cellulare o esaurire marcatori a base di proteine, in particolare all'interno della zona ischemica nucleo.
Il principio della tecnica è presentata nella Figura 1. La figura mostra sonde oligonucleotidiche a forma di forcina ligati per l'enzima topoisomerasi vaccinia (VACC TOPO) al DNA 5'OH finisce generato da lisosomiale DNasi II durante la digestione DNA 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo video si dimostra, nel formato sezione di tessuto, come etichettare fagociti attivi che chiare morte delle cellule in ischemia cerebrale focale. La tecnica presentata è il primo approccio che le etichette specificamente solo le celle di gestione dei rifiuti che hanno inghiottito e digerire attivamente cadaveri cellulari. Questo rende più vantaggiosa rispetto ad altri metodi esistenti per l'etichettatura dei fagociti, che non hanno questa capacità.
Il metodo utilizza un indic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni R01NS062842 dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e ictus, National Institutes of Health (VVD) e da sovvenzioni R21 NS064403 dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e ictus, National Institutes of Health, attraverso ARRA (VVD) e R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
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- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
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