La evaluación de Liquidación fagocítica de muerte celular en el accidente cerebrovascular experimental por ligables Fluorescent Probes
Summary
Se presenta una nueva técnica de fluorescencia para selectivo etiquetado in situ de las células fagocitarias activas, que claro off cadáveres de células en el accidente cerebrovascular. El enfoque es importante para evaluar la reacción del cerebro a la isquemia debido a que sólo una pequeña proporción de los fagocitos presentes en el cerebro isquémico participar en el aclaramiento de la muerte celular.
Abstract
Se describe un nuevo método histoquímico para la visualización del despacho fagocítica en la isquemia cerebral focal. El enfoque permite el estudio de la eliminación de las células muertas en el accidente cerebrovascular por los fagocitos de gestión de residuos de cualquier linaje celular. Aunque numerosas células de diferentes orígenes que son capaces de fagocitosis están presentes en el cerebro isquémico, sólo una parte de ellos engullir activamente y digerir cadáveres de células. La visualización selectiva, cuantificación y análisis de dicha gestión de residuos activa fagocítica son útiles en la evaluación de la respuesta cerebral a la isquemia. Despacho eficiente la muerte celular es importante para la recuperación de la lesión isquémica cerebral, ya que abre el camino para que los procesos de regeneración posteriores. La falta de limpieza de los cadáveres daría lugar a una reacción tóxica causada por el ADN no degradado y proteínas. El procedimiento descrito utiliza sondas fluorescentes ligadas selectivamente por una topoisomerasa viral a roturas en el ADN característicos producidos en todos los fagocitos durante la inmersióny la digestión de las células irreversiblemente dañado por la isquemia. El método es una nueva herramienta para la investigación de la reacción del cerebro a la lesión isquémica.
Introduction
El accidente cerebrovascular isquémico induce cambios profundos en el tejido cerebral afectado. Se inicia la muerte celular masiva, que conduce a la rápida activación de las células fagocíticas residentes de origen microglial. También pone en marcha la infiltración de cerebro isquémico por varios tipos de fagocitos profesionales derivadas de la sangre incluyendo neutrófilos, macrófagos, dendríticas, y mastocitos 1,2.
Todavía se debate si esta respuesta a la lesión isquémica desempeña un positivo o un papel negativo. Aunque la fagocitosis después del accidente cerebrovascular puede ser beneficioso, ya que borra las células muertas y suprime la inflamación, sino que también genera especies reactivas de oxígeno tóxicos que afectan la supervivencia neuronal y exacerbando el daño tisular 1-5.
Mientras que varios tipos de células fagocíticas infiltran cerebral isquémico, no todos ellos participan en la gestión de residuos por que envuelve los cuerpos celulares y despejando el camino para los procesos regenerativos 1-3. Este creates un requisito para la identificación selectiva de las células de gestión de residuos que llevan a cabo aclaramiento fagocítica de muerte celular en el accidente cerebrovascular. Cuando proyección de imagen tales células de gestión de residuos activos, también es importante responder a la cuestión de la eficiencia con que se degradan los cadáveres celulares envueltos. La degradación de la efectiva y completa del ADN de la célula que muere en la fagocitosis es esencial, ya que impide la auto-inmunización y la liberación de material nuclear patológica 6.
Aquí presentamos nuevas sondas que utilizan saltos de ADN específicas como marcadores de células fagocitarias activas. Estas interrupciones de la firma se producen exclusivamente durante la ruptura de núcleos envueltos dentro de las células de gestión de residuos funcionales. Por lo tanto las sondas marcadoras selectivamente sólo los fagocitos que engullen y digieren activamente cadáveres celulares. También permiten la observación de la intensidad y la finalización de la ruptura de ADN después de la inmersión. Las sondas son útiles en la evaluación de la intensidad y efficirencia del despacho fagocítica.
Las nuevas sondas se basan en un marcador no basado en proteína-y por lo tanto pueden ser particularmente ventajosa en los estudios de accidente cerebrovascular, donde extensa daño isquémico puede alterar la morfología celular o agotar marcadores a base de proteínas, especialmente dentro de la zona isquémica núcleo.
El principio de la técnica se presenta en la Figura 1. La figura muestra las sondas de oligonucleótidos en forma de horquilla-ligados por la enzima topoisomerasa de vaccinia (VACC TOPO) al ADN 5'OH termina generada por lisosomal ADNasa II durante la digestión de ADN 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este video se demuestra, en el formato de la sección de tejido, como etiquetar los fagocitos activos que clara la muerte celular en la isquemia cerebral focal. La técnica presentada es el primer enfoque que marca específicamente sólo las células de gestión de residuos, que han afectado y digerir activamente cadáveres celulares. Esto hace que sea ventajoso con respecto a otros métodos existentes para el etiquetado de las células fagocíticas, que no tienen esta capacidad.
El méto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por conceder R01NS062842 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, Institutos Nacionales de Salud (VVD) y por subvenciones R21 NS064403 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, Institutos Nacionales de Salud a través de ARRA (VVD) y R21 Instituto Nacional EB006301 de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería, Institutos Nacionales de Salud (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
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