マウスにおける造影MRIによる視神経線維の整合性in vivoイメージング
Summary
このビデオでは、ナイーブマウス視覚投影の造影MRイメージングのための急性視神経挫滅損傷および慢性視神経変性に関連視神経変性の繰り返しと縦のin vivo試験では、臨床3 Tスキャナを使用して、方法を示しているノックアウトマウス（P50 KO）。
Abstract
齧歯類の視覚システムは、視床と中脳の中心を入力する視神経を形成する網膜神経節細胞とその軸索を包含し、視覚野のシナプス後予測。その明確な解剖学的構造、便利なアクセス可能性に基づいて、ニューロンの生存、軸索再生、およびシナプス可塑性の研究のために好ま構造となっています。 MRイメージングにおける最近の進歩は、マンガン媒介コントラスト強調（MEMRI）を使用して、この突起のレチノ-視蓋部分のin vivo可視化を可能にした。ここでは、（200ミクロン）3の解像度は一般的な3テスラスキャナを用いて達成することが可能なマウスにおける視覚投影、MEMRIを説明するためのプロトコルを提供する。私たちは、15ナノモルのMnCl 2の単回投与量の硝子体内注射は24時間以内で完全な投影の飽和向上につながる方法を示しています。網膜を除いて、信号強度の変化が独立しているその一致視覚刺激または生理的老化の凹み。私たちは、縦方向に、この手法をさらに適用する軸索急性視神経損傷を受けて変性症はMn 2 +輸送によるパラダイム病変部位で完全に逮捕を監視します。逆に、活性の Mn 2 +輸送は、生存率、数、および軸索線維の電気的活性に定量的に比例する。このような分析のために、我々は視覚的な突起を含む感覚の自発的な萎縮を表示するトランスジェニックマウスモデル（NF-κB活性P50 KO）での視覚的なパスに沿っての Mn 2 +輸送動態を例示している。これらのマウスでは、MEMRIは減少したが、このようにしてNF-κBの突然変異により、構造および/ または機能障害の徴候を明らかにし、野生型マウスと比較しての Mn 2 +輸送を遅延しないことを示します。
要約すると、MEMRIは便利in vivoアッセイを橋渡しし、characterizatiための死後の組織学を投稿神経線維の完全性と活動の上。これは、縦方向の軸索変性と再生に関する研究、本物または誘導性表現型変異マウスの調査のために非常に有用である。
Introduction
その有利な神経解剖学的構造に基づいて、げっ歯類の視覚系は、神経保護1又はプロ再生効果2,3を媒介するために、薬理学的化合物およびそれらの能力を評価するためにユニークな可能性を提供しています。また、最近では、シナプス前足場タンパク質ファゴット4を欠損したマウスで例示したように、マウスの突然変異体の機能的および神経解剖学的特性の研究を可能にします。さらに、補助的なツールの広いスペクトルが電図および行動試験、および固有信号の光イメージングによる皮質再配列の決定により、 例えば 、網膜神経節細胞（RGC）とのRGC軸索番号だけでなく、RGC活性の特色に追加与える。レーザー顕微鏡の最新技術開発が視神経（ON）と脳のホールマウント標本の深い組織蛍光イメージングによってRGC再生の現場での可視化を可能にする。このhistolog中iCalのアプローチは、光シート蛍光顕微鏡と組み合わせて、テトラヒドロフランに基づく組織のクリアをONに求心路遮断および視索5に再入力する単繊維の解像度を可能にします。このような技術は、解像度と成長パターンの決定に優れているかもしれませんが、彼らは、特に長期的な再生過程を評価することが望まれている個々の成長の節目、の繰り返しと縦の分析を有効にしないでください。
造影MRIは、マウスおよびラット6,7における網膜視蓋投影の最小侵襲的可視化のために採用されています。これは、網膜細胞の常磁性イオン（ 例えば 、Mnが2 +）の直接眼内送達によって達成することができる。カルシウムアナログとしてはMn 2 +が電位依存性カルシウムチャネルを経由して、RGC細胞体に組み込まれ、積極的に無傷で、ONと視神経管の軸索細胞骨格に沿って搬送。それは脳核内に蓄積しながら、それが10,11発生することがありますが、視覚的投影、外側膝状核（LGN）と上丘（SC） すなわち 、一次視覚野への経シナプス伝達は、無視できる程度の8,9が表示されます。 MR配列決定の下、常磁性の Mn 2 +は、T 1スピン-格子緩和時間12を短くすることにより、主にMRコントラストを増強する。例えばMn 2 +、MRI（MEMRI）が正常に傷害13,14後の軸索再生および変性の評価を含めたラットの様々な神経解剖学的および機能的研究に適用されている強化され、レチノ-視蓋投影15の正確な解剖学的マッピング薬物治療16後の軸索輸送特性だけでなく、決定。 の Mn 2 +の取り込み及び輸送神経細胞だけでなく、改善されたMRIプロトコルの投与量、毒性、および動力学における近年の改良により、トランスジェニックの研究への適用を拡大してきた一般的に臨床現場で使用される17 3テスラスキャナを用いて、マウス9。
ここでは、マウスの網膜視蓋投影のインビボ画像化に適した長手MEMRIプロトコルを提示し、ナイーブおよび種々の神経変性条件下での Mn 2 +依存性のシグナル増強を評価することにより、その適用性を例示する。我々のプロトコルは、一般的に、専用の動物のスキャナよりもアクセスすることが適度な3 Tの磁場でMRデータ収集上の特定の重点を置きます。ナイーブマウスでは、腸管固有の信号強度が、実質的にかつ再現性硝子（ivit） の Mn 2 +アプリケーションの後に増加になることができる方法を示しています。定量的には、視覚投影に沿っての Mn 2 +伝播が（3と26カ月齢のマウスの間で測定される）正常な老化プロセスとは独立して発生し、増加は暗闇に視覚刺激と適応に難治性である。対照的に、マンガン<s> 2 +上視床および中脳センターの濃縮は、自発的アポトーシスRGC死からおよび変性19日苦しんでノックアウトマウス（P50 KO）挫滅18急性だけでなく、NFKB1で以下に減少する。このように、従来の組織学的分析による膨張で、個々の動物の縦MEMRI分析は、神経変性プロセスのユニークな反応速度のプロファイリングを可能にします。これは、薬理学的または遺伝的な介入に関連した神経保護および軸索再生の研究のために有用であることを証明する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
視覚系のMEMRIはナイーブおよび病理学的条件下での機能性を評価するための従来の神経生物学の手法を拡張します。離れて孤立した中枢神経系の線維トラクトの整合性にユニークな洞察を提供するから、MEMRIを簡単に視覚に指定されたパラダイムの即時の影響を調査するために、行動試験、 例えば 、検眼、視覚ベースの水作業を補充することができます。また、電気生理学的および…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AKは、オッペンハイム財団とRHベルックス財団によってサポートされているサポートされています。私たちは、組織学的サポートのための技術的およびK. BuderのためI. Krumbeinに感謝し、TIMM染色に技術的助言のためのJ·ゴールドシュミット（神経生物学、マクデブルク、ドイツのためのライプニッツ研究所）。
Materials
| Manganese (II) chloride solution 1M | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M1787 | MEMRI contrast reagent |
| Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 7617666 | 0.4% oxybuprocaine hydrochloride |
| Floxal eye drops | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 3820927 | 3 mg/ml ofloxacin |
| Ointment panthenol | Jenapharm, Jena, Germany | PZN 3524531 | |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | C8383 | 420-450 mg/kg body weight |
| Isoflurane | Actavis, Munich, Germany | PZN 7253744 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 7634-01 | SYR 5 µl, 75 RN, no NDL |
| 34 G needle (34/35/pst4/tapN) | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 207434/00 | removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4 |
| Binocular Stemi-2000 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| 3T MRI scanner Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany | ||
| Rat head coil | Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA | ||
| Mouse holder | custom made | ||
| Red light lamp | |||
| Frozen section medium NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 6502 | tissue embedding for cryo-sections |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) | Merck, Darmstadt, Germany | 106346 | for sulfide perfusion |
| Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | 208043 | |
| gum arabic | Roth, Arlesheim, Switzerland | 4159 | for TIMM staining |
| Hydroquinone (C6H6O2) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
| Citric acid (C6H8O7) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 6490 | |
| Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) | Merck, Darmstadt, Germany | 106448 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 | |
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