Summary

В естественных изображений зрительного нерва волокна целостность контрастным усилением МРТ у мышей

Published: July 22, 2014
doi:

Summary

Это видео иллюстрирует способ, с помощью клинического 3 T сканера, для контрастированием МР томографии наивным мыши визуальной проекции и для повторяющихся и продольных естественных условиях исследования в зрительного нерва дегенерации, связанных с острым повреждением зрительного нерва на раздавливание и хронической дегенерации зрительного нерва в нокаут-мышей (р50 КО).

Abstract

Грызун визуальная система охватывает ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов, которые формируют зрительный нерв, чтобы войти таламическое и среднего мозга центры и постсинаптические прогнозы на зрительной коре. На основе своего специфического анатомического строения и удобной доступности, он стал излюбленным структура исследований по выживаемости нейронов, регенерации аксонов и синаптической пластичности. Последние достижения в области МРТ позволили визуализации в естественных условиях ретинобластому tectal части этой проекции с использованием марганца опосредованной повышение контрастности (MEMRI). Здесь мы приводим протокол MEMRI для иллюстрации визуальной проекции у мышей, которым резолюции (200 мкм) 3 может быть достигнуто с помощью обычных 3 Tesla сканеры. Мы показываем, как инъекция из одного дозировке 15 нмоль MnCl 2 приводит к насыщенному повышения неповрежденной проекции в 24 час. За исключением сетчатки, изменения в интенсивности сигнала не зависятвмятина от совпадали визуальной стимуляции или физиологического старения. Кроме того, мы применить эту технику для продольно контролировать дегенерацию аксонов в ответ на острый зрительного повреждения нерва, парадигма, по которому Mn 2 + транспорт полностью аресты на месте повреждения. С другой стороны, активное Mn 2 + транспорт количественно пропорциональна жизнеспособности, числа и электрической активности аксонов волокон. Для такого анализа мы примером Mn 2 + транспортные кинетики вдоль зрительной пути в трансгенных мышах (NF-kB р50 KO), где отображаются спонтанное атрофию сенсорные, в том числе визуальных, прогнозов. У этих мышей MEMRI указывает снижается, но не задерживается Mn 2 + транспорт по сравнению с мышами дикого типа, обнаруживая таким образом признаки структурных и / или функциональных нарушений на NF-kB мутаций.

Таким образом, MEMRI удобно соединяет в естественных условиях анализов и послеубойную гистологии для characterizatiна целостности нервных волокон и деятельности. Это очень полезно для продольных исследований по дегенерации аксонов и регенерации, и исследований мутантных мышей для подлинных или индуцибельных фенотипов.

Introduction

На основе его благоприятного нервно-анатомические структуры грызун визуальная система предоставляет уникальные возможности для оценки фармакологических соединений и их способность быть посредником нейропротекцию 1 или про-регенеративный эффект 2,3. Кроме того, она позволяет исследования по функциональной и нейро-анатомических характеристик мутантных мышей, как это недавно примера для мышей, лишенных пресинаптического строительных лесов белок Фагот 4. Кроме того, широкий спектр дополнительных инструментов дает дополнительные показывая сетчатки ганглиозных клеток (РГК) и РГК чисел аксонов, а также РГК деятельности, например, путем электроретинографии и поведенческих тестов и определения корковых перестроек оптическим визуализации внутренних сигналов. Новейшие технические разработки в лазерной микроскопии позволяют на месте визуализации регенерации РГК глубокой ткани флуоресцентной визуализации в целых монтирования образцов зрительного нерва (ON) и мозга. В этом histologческих подход, тетрагидрофуран основе ткани очистка в сочетании с легкой листовой флуоресцентной микроскопии позволяет решить одиночных волокон, что повторного ввода в деафферентированной ON и зрительного тракта 5. В то время как такие методы могли бы быть выше в разрешении и определения моделей роста, они не позволяют повторяющиеся и продольные анализ отдельных событий роста, которые особенно желательных оценить процесс долгосрочного регенерации.

С контрастным усилением МРТ был использован для минимально инвазивной визуализации проекции ретино-tectal у мышей и крыс 6,7. Это может быть достигнуто путем непосредственного внутриглазной доставке парамагнитных ионов (например, Mn 2 +) к клеток сетчатки. В аналоговых кальция, Mn 2 + включен в РГК somata через напряжения закрытого кальциевых каналов и активно транспортируется вдоль аксонов цитоскелета неповрежденной ON и зрительного тракта. В то время как он накапливается в ядрах мозгавизуального проектирования, т.е. латерального коленчатого тела (LGN) и верхний бугорок (SC), transsynaptic распространения в первичной зрительной коре появляется незначительным 8,9, хотя это может произойти 10,11. Под MR последовательности, парамагнитного Mn 2 + увеличивает MR контраст в основном за счет сокращения T 1 спин-решеточной релаксации 12. Такое Mn 2 + МРТ с (MEMRI) успешно применяется в различных нервно-анатомических и функциональных исследований крыс, в том числе оценки регенерации аксонов и дегенерации после ON травмы 13,14, точное анатомическое отображение ретино-tectal выступа 15 , а также определения аксонов транспортных характеристик после медикаментозного лечения 16. Последние уточнения в лекарственных, токсичности и кинетики нейронных Mn 2 + поглощение и транспорт, а также усовершенствованных протоколов МРТ расширили свое применение в исследованиях по трансгенныхмышей 9 с использованием 3 Tesla сканеры, обычно используемые в клинической практике 17.

Здесь мы представляем MEMRI протокол, подходящий для продольное естественных изображений мыши ретино-tectal проекции и примером его применения на основе оценки Mn 2 + в зависимости усиление сигнала в наивных и различных условиях нейродегенерацию. Наш протокол ставит конкретную акцент на сбор данных MR в умеренном 3 T магнитного поля, что, как правило, более доступны, чем выделенных сканеров животных. В наивных мышей, мы проиллюстрируем, как интенсивность сигнала тракта конкретных может быть существенно и воспроизводимо стать увеличилось после стекловидное тело (ivit) Mn 2 + приложения. Количественно, Mn 2 + распространения вдоль зрительной проекции происходит независимо от нормального процесса старения (измеряется от 3 ​​до 26-месячным мышам) и приумножение не поддается визуальной стимуляции и адаптации к темноте. В противоположность этому, Mn <sдо> 2 + обогащение таламуса и среднего мозга центров уменьшается после острого НА травмы раздавить 18, а также в nfkb1 нокаут-мышей (р50 KO) страдает от спонтанного апоптоза РГК смерти и ПО дегенерации 19. Таким образом, в расширении к обычной гистологического анализа, продольный MEMRI анализ отдельных животных позволяет профилирование уникальных кинетики нейродегенеративных процессов. Это должно оказаться полезным для исследований по нейропротекции и регенерации аксонов, связанных с фармакологическими или генетических вмешательств.

Protocol

Все вмешательства животных проводятся в соответствии с Европейской конвенцией по уходу за животными и использованию лабораторных животных и Заявление о ARVO для использовании животных в офтальмологической и Vision Research. Все эксперименты одобрено местным комитетом по этике. Пор?…

Representative Results

Способность этого метода воображения, чтобы точно оценить жизнеспособность и функциональность визуального проектирования опирается на точного применения нетоксичной Mn 2 + дозировке в стекловидное тело и его поглощением РГК. Этот крупный предположение проверяется на рисун?…

Discussion

MEMRI зрительной системы распространяется обычные нейробиологические методики для оценки функциональности под наивных и патологических состояний. Помимо предоставления уникальную возможность заглянуть в целостности изолированной ЦНС волокна тракта, MEMRI может быть легко дополнен пов…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

АК поддерживается Oppenheim фонда и относительной влажности поддерживается Фондом Velux. Мы благодарим I. Krumbein технической и К. Будер для гистологического поддержки, Дж. Гольдшмидт (Лейбниц Институт нейробиологии, Магдебург, Германия) для технических консультаций по окрашиванию Тимм.

Materials

Manganese (II) chloride solution 1M Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M1787 MEMRI contrast reagent
Conjuncain Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 7617666 0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 3820927 3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol Jenapharm, Jena, Germany PZN 3524531
Chloral hydrate  Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany C8383 420-450 mg/kg body weight
Isoflurane Actavis, Munich, Germany PZN 7253744
Hamilton syringe  Hamilton Company, Reno, NV, USA 7634-01 SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G  needle (34/35/pst4/tapN) Hamilton Company, Reno, NV, USA 207434/00 removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000 Zeiss, Oberkochen, Germany
3T MRI scanner Magnetom TIM Trio Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 6502 tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) Merck, Darmstadt, Germany 106346 for sulfide perfusion 
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany 208043
gum arabic Roth, Arlesheim, Switzerland 4159 for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2) Roth, Arlesheim, Switzerland 3586
Citric acid (C6H8O7) Roth, Arlesheim, Switzerland 6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106448
Silver nitrate (AgNO3) Roth, Arlesheim, Switzerland 7908

References

  1. Kretz, A., et al. Simvastatin promotes heat shock protein 27 expression and Akt activation in the rat retina and protects axotomized retinal ganglion cells in vivo. Neurobiol Dis. 21, 421-430 (2006).
  2. Lima, S., et al. Combinatorial therapy stimulates long-distance regeneration, target reinnervation, and partial recovery of vision after optic nerve injury in mice. Int Rev Neurobiol. 106, 153-172 (2012).
  3. Lima, S., et al. Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9149-9154 (2012).
  4. Goetze, B., et al. Vision and visual cortical maps in mice with a photoreceptor synaptopathy: reduced but robust visual capabilities in the absence of synaptic ribbons. Neuroimage. 49, 1622-1631 (2010).
  5. Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
  6. Pautler, R. G., et al. In vivo neuronal tract tracing using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Magn Reson Med. 40, 740-748 (1998).
  7. Watanabe, T., et al. Mapping of retinal projections in the living rat using high-resolution 3D gradient-echo MRI with Mn2+-induced contrast. Magn Reson Med. 46, 424-429 (2001).
  8. Pautler, R. G. In vivo, trans-synaptic tract-tracing utilizing manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). NMR biomed. 17, 595-601 (2004).
  9. Haenold, R., et al. Magnetic resonance imaging of the mouse visual pathway for in vivo studies of degeneration and regeneration in the CNS. Neuroimage. 59, 363-376 (2012).
  10. Lindsey, J. D., et al. Magnetic resonance imaging of the visual system in vivo: transsynaptic illumination of V1 and V2 visual cortex. Neuroimage. 34, 1619-1626 (2007).
  11. Bearer, E. L., et al. Role of neuronal activity and kinesin on tract tracing by manganese-enhanced MRI (MEMRI). Neuroimage. 37, S37-S46 (2007).
  12. Mendonca-Dias, M. H., et al. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Semin Nucl Med. 13, 364-376 (1983).
  13. Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the optic visual pathway and optic nerve injury in adult rats. J Magn Reson Imaging. 22, 492-500 (2005).
  14. Sandvig, I., et al. In vivo MRI of olfactory ensheathing cell grafts and regenerating axons in transplant mediated repair of the adult rat optic nerve. NMR biomed. 25, 620-631 (2012).
  15. Chan, K. C., et al. In vivo retinotopic mapping of superior colliculus using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Neuroimage. 54, 389-395 (2011).
  16. Chan, K. C., et al. In vivo chromium-enhanced MRI of the retina. Magn Reson Med. 68, 1202-1210 (2012).
  17. Herrmann, K. H., et al. Possibilities and limitations for high resolution small animal MRI on a clinical whole-body 3T scanner. Magma. 25, 233-244 (2012).
  18. Villegas-Perez, M. P., et al. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
  19. Takahashi, Y., et al. Development of spontaneous optic neuropathy in NF-κΒ50-deficient mice: requirement for NF-κΒp50 in ganglion cell survival. Neuropathol Appl Neurobiol. 33, 692-705 (2007).
  20. Herrmann, K. H. P., et al. MRI compatible small animal monitoring and triggering system for whole body scanners. Z Med Phys. 24, 55-64 (2013).
  21. Danscher, G., Zimmer, J. An improved Timm sulphide silver method for light and electron microscopic localization of heavy metals in biological tissues. Histochemistry. 55, 27-40 (1978).
  22. Angenstein, F., et al. Manganese-enhanced MRI reveals structural and functional changes in the cortex of Bassoon mutant mice. Cereb cortex. 17, 28-36 (2007).
  23. Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the rat visual pathway: acute neural toxicity, contrast enhancement, axon resolution, axonal transport, and clearance of Mn(2). J Magn Reson Imaging. 28, 855-865 (2008).
  24. Lehmann, K., et al. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restor Neurol Neurosci. 30, 161-178 (2012).
  25. Takeda, A., et al. Manganese transport in the neural circuit of rat CNS. Brain Res Bull. 45, 149-152 (1998).
  26. Nairismagi, J., et al. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging of mossy fiber plasticity in vivo. Neuroimage. 30, 130-135 (2006).
  27. Smith, K. D., et al. In vivo axonal transport rates decrease in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neuroimage. 35, 1401-1408 (2007).
  28. Berkowitz, B. A., et al. Noninvasive and simultaneous imaging of layer-specific retinal functional adaptation by manganese-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2668-2674 (2006).
  29. Schnapf, J. L. B. D. A. How photoreceptor cells respond to light. Sci. Am. 256 (8), (1987).
  30. Yu, X., et al. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat Neurosci. 8, 961-968 (2005).
  31. Sun, S. W., et al. Noninvasive topical loading for manganese-enhanced MRI of the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 3914-3920 (2011).
  32. Sun, S. W., et al. Impact of repeated topical-loaded manganese-enhanced MRI on the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4699-4709 (2012).

Play Video

Cite This Article
Fischer, S., Engelmann, C., Herrmann, K., Reichenbach, J. R., Witte, O. W., Weih, F., Kretz, A., Haenold, R. In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51274, doi:10.3791/51274 (2014).

View Video