Sekventiell<em> In vivo</em> Imaging av Osteogena Stem / progenitorceller Under Fracture Repair

Summary

Kvantitativ mätning av ben progenitor funktion i frakturläkning kräver hög upplösning seriebildteknik. Här finns protokoll föreskrivs att använda intravital mikroskopi och osteo-härstamning spårning att sekventiellt bild och kvantifiera migration, proliferation och differentiering av endogena osteogena stamceller / progenitorceller i färd med att reparera benbrott.

Abstract

Bone vänder över kontinuerligt och är mycket regenerativ efter skada. Osteogena stam / föregångarceller har länge varit en hypotes att existera, men in vivo demonstration av sådana celler har först nyligen uppnåtts. Här är in vivo avbildningstekniker för att undersöka betydelsen av endogena osteogena stamceller / progenitorceller (OSPCs) och deras avkomma i ben reparation tillhandahålls. Med hjälp av osteo-härstamning cell spåra modeller och intravital avbildning av inducerade mikrosprickor i calvarial ben, kan OSPCs observeras direkt under de första dagarna efter skada, där kritiska händelser i den tidiga reparationen inträffar. Skade webbplatser kan sekventiellt avbildas avslöjar att OSPCs flytta till skadan, öka i antal och differentierar till benbildande osteoblaster. Dessa metoder är ett sätt att undersöka rollen av stamceller-inre och yttre molekylära regulatorer för benuppbyggnad och reparation.

Introduction

Degenerativa skelettsjukdomar och åldersrelaterad benförlust som leder till en hög risk för osteoporosfraktur har blivit en stor utmaning i folkhälso ^1. Bone underhåll styrs av benbildande osteoblaster och benresorberande osteoklaster. Fel i benbildande celler är den huvudsakliga orsaken till åldersrelaterad benförlust och degenerativa bensjukdomar ^2,3. Medan omfattande forskning har fokuserat på att förbättra frakturläkning, till upptäckten av tillförlitliga läkemedel bota degenerativa sjukdomar ben och att vända den svaga benskörhetsfrakturer är fortfarande en viktig fråga. Således, studera källan till benbildande celler och deras kontrollmekanismer i benuppbyggnad och reparation ger en ny insikt för att öka skelett förnyelse och vända benförlust sjukdomar.

Förekomsten av multipotenta mesenkymala celler i benmärgen har föreslagits utifrån identifieringen av klonogena populationer som kan olikasent i osteogent, adipogena och kondrogena härstamningar ex vivo ^4. Nyligen, flera studier har rapporterat att skelett / mesenkymala stamceller (SSC / MSC) är en naturlig källa av osteoblaster och är avgörande för benomsättningen, ombyggnad, och fraktur reparation ^5,6 . Dessutom visade vår släktlinje-spårning studie att mogna osteoblaster har ett oväntat kort halveringstid (~ 60 dagar) och kontinuerligt fyllas på av deras stam / progenitorceller i både normala homeostatiska och fraktur reparation förhållanden ^6. Emellertid identiteten in vivo av stamceller och hur sådana celler reagerar till fraktur skada och leverera benbildande celler är oklara. Därför är det viktigt att utveckla en metod som kan analysera migration, proliferation och differentiering av endogena stålcentraler / MSC i under fysiologiska förhållanden.

Frakturreparation är en multi-cellulär och dynamisk process som regleras av en matris av komplexacytokiner och tillväxtfaktorer ^7. Den mest populära metod för frakturstudier är att använda en djurmodell med lång benfraktur och analysera ben av ben sektione och immunofluorescerande teknik ^8-10. Denna reparationsprocess kan följas av flera avbildningstekniker, inklusive mikro-CT ^11, nära infraröda fluorescens ^12, och kemiluminescens avbildning ^13. Men varje teknik vissa begränsningar, och det har medfört några effektiva sätt att övervaka SSC / MSC-funktion på cellnivå in vivo. Nyligen har konfokala / två-foton intravital mikroskopi utvecklats och används för att upptäcka transplanterade cancerceller och hematopoetiska stamceller i samband med sin benmärg mikromiljö även vid encelliga upplösning i levande djur ^14. Genom att kombinera denna teknik med en serie av härstamning spåra modeller, kunde vi fastställa att osteogena stam / progenitorceller kan genetiskt präglad av övergående acmotivation för myxovirus motstånd -1 (Mx1) promotor och Mx1-inducerad progenitorer kan bibehålla merparten av mogna osteoblaster över tid, men inte deltar i genereringen av kondrocyter i den vuxna musen ^6. Dessutom visade vi att Mx1-märkta OSPCs levererar majoriteten av nya osteoblaster i frakturläkning ^6.

Här, med hjälp av osteo-härstamning spårning modeller och intravital mikroskopi, är ett protokoll som att definiera vivo kinetik Mx1 ⁺ osteogena stam / progenitorceller i i fraktur reparation. Detta protokoll ger sekventiell avbildning att spåra flytten av osteogena stamceller / progenitorceller i brottplatser och kvantitativ mätning av osteoprogenitorcell expansion i början av reparationsprocessen. Detta tillvägagångssätt kan vara användbart i flera sammanhang, inklusive utvärderingen av terapeutiska kandidater för att förbättra benläkning.

Protocol

1. Möss och Förkonditionering OBS: Alla möss bibehölls i patogenfria förhållanden och alla protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Massachusetts General Hospital. All kirurgi bör utföras under sterila betingelser med hjälp av autoklav steril utrustning. Mx1-Cre 15, ROSA26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), och ROSA26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-tomat), var köptes från Jackson Laboratories. osteocalcin-G…

Representative Results

Den stabiliserade lång benfraktur modellen har varit populärt i frakturstudier. Men långa ben eller stora brottmodeller orsakar flera vävnadsskada och därför har en begränsning i kvantitativ mätning av ben cellfunktion. Vi utvecklade en minimalt invasiv skada (mindre än 1 mm i diameter med minimal eller ingen invasion i dura mäter) på calvarial pannben med nål borrning (fig. 1A-1C). Vi valde en vy ovanifrån av de calvarial pannben för in vivo levande avbildning av mikrospric…

Discussion

Regleringen av skelett stamceller kan vara av stor betydelse för att definiera bättre metoder för att uppnå benregenerering. Kvantitativ och sekventiell avbildning på cellnivå har varit en teknisk utmaning. Även musen lång benfraktur modellen har använts i stor omfattning och som lämpar sig för biomekaniska studier ^17, har sitt djup vävnad läge, ojämn fraktur storlek, mjukvävnadsskada, och tillämpningen av stabiliserande fixators begränsad sekventiell intravital avbildning. Här beskrivs en m…

Materials

C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664
Ketamine Hydrochloride Injection	Bionichepharma	67457-001-10	Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236
Buprenorphine Hl	BEDFORD LAB	NDC 55390-100-10	Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X	CORNING cellgro	21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol)	Kendall WEBCOL	5110
Fine Surgical Scissor	F.S.T	14568-09
Extra fine Forceps	F.S.T	11150-10
VICRYL*Plus Suture	Ethicon	VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot	Invitrogen	Q21061
Methocel 2%	OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)	Sigma	P0913-50MG	100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers	Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser	Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser	Coherent