Secuencial<em> En vivo</em> Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura
Summary
La medición cuantitativa de la función de progenitores de médula en la curación de la fractura requiere alta resolución tecnología de imágenes en serie. Aquí, se proporcionan protocolos para el uso de microscopía intravital y seguimiento osteo-linaje secuencialmente imagen y cuantificar la migración, proliferación y diferenciación de osteogénicas células madre / progenitoras endógenas en el proceso de reparación de fractura ósea.
Abstract
Hueso vuelca continuamente y es muy regenerativa tras una lesión. Células madre / progenitoras osteogénicas larga han sido la hipótesis de existir, sino con demostración in vivo de tales células sólo recientemente se ha alcanzado. En este caso, se proporcionan en las técnicas de imagen in vivo para investigar el papel de las células madre / progenitoras osteogénicas endógenos (OspC) y su progenie en la reparación ósea. El uso de células osteo-linaje modelos de rastreo y de imagen intravital de microfracturas inducidas en calota, OspC se puede observar directamente durante los primeros días después de la lesión, en la que se producen los eventos críticos en el proceso de reparación temprana. Lesiones sitios se pueden obtener imágenes de forma secuencial revela que OspC reubicar a la lesión, aumenta en número y se diferencian en osteoblastos que forman los huesos. Estos métodos ofrecen un medio para investigar el papel de los reguladores moleculares de células madre-intrínsecos y extrínsecos para la regeneración ósea y la reparación.
Introduction
Enfermedades óseas degenerativas y la pérdida ósea relacionada con la edad que conduce a un alto riesgo de fractura por osteoporosis se ha convertido en un reto importante en la salud pública 1. Mantenimiento óseo está controlado por los osteoblastos forman el hueso y los osteoclastos de resorción ósea. Los defectos de las células formadoras de hueso son una causa principal de la pérdida ósea relacionada con la edad y las enfermedades óseas degenerativas 2,3. Si bien una amplia investigación se ha centrado en la mejora de la curación de la fractura, el descubrimiento de fármacos fiables para curar enfermedades degenerativas del hueso y para revertir la debilidad de las fracturas osteoporóticas sigue siendo un problema importante. Por lo tanto, el estudio de la fuente de células formadoras de hueso y sus mecanismos de control en la regeneración ósea y la reparación proporciona una nueva visión para mejorar la regeneración del esqueleto y revertir enfermedades de pérdida ósea.
La existencia de células mesenquimales multipotentes en la médula ósea se ha propuesto sobre la base de la identificación de poblaciones clonogénicas que podía diferenteIATE en osteogénico, linajes adipogénicos y condrogénicas ex vivo 4. Recientemente, varios estudios han informado de que las células madre del esqueleto / mesenquimales (SSC / MSC) son una fuente natural de los osteoblastos y son fundamentales para la renovación ósea, remodelación y reparación de la fractura 5,6 . Además, nuestro estudio de trazado de linaje revelado que los osteoblastos maduros tienen una vida media corta inesperadamente (~ 60 días) y se reponen continuamente por sus células madre / progenitoras en ambas condiciones homeostáticas y reparación de fracturas normales 6. Sin embargo, la identidad in vivo de células madre y cómo tales células reaccionan a la fractura lesión y suministrar las células formadoras de hueso no son claras. Por lo tanto, es importante desarrollar un método que es capaz de analizar la migración, proliferación y diferenciación de las ESC endógenos / MSC en bajo circunstancias fisiológicas.
Reparación de la fractura es un proceso de múltiples celular y dinámica regulada por una matriz de complejocitocinas y factores de crecimiento 7. El enfoque más popular para los estudios de fractura es el uso de un modelo animal con la fractura de los huesos largos y para analizar los huesos por seccionamiento hueso y técnicas de inmunofluorescencia 8-10. Este proceso de reparación puede ser supervisada por múltiples técnicas de imagen incluyendo micro-CT 11, la fluorescencia del infrarrojo cercano 12, y de formación de imágenes de quimioluminiscencia 13. Sin embargo, cada técnica tiene ciertas limitaciones y no ha habido manera efectiva de controlar la función ESC / MSC a nivel celular in vivo. Recientemente, confocal / de dos fotones microscopía intravital se ha desarrollado y utilizado para detectar células de cáncer trasplantado y las células madre hematopoyéticas en el contexto de su microambiente de la médula ósea, incluso con una resolución de una sola célula en animales vivos 14. Mediante la combinación de esta tecnología con una serie de modelos de rastreo de linaje, hemos sido capaces de definir que las células madre osteogénico / progenitoras se pueden marcar genéticamente por ac transitoriavación de la resistencia myxovirus -1 (Mx1) promotor y progenitores inducida Mx1-puede mantener la mayoría de los osteoblastos maduros con el tiempo, pero no participar en la generación de condrocitos en el ratón adulto 6. Además, hemos demostrado que OspC etiquetados-MX1 suministran la mayoría de los nuevos osteoblastos en la curación de fracturas 6.
En este caso, el uso de modelos de seguimiento de osteo-linaje y microscopía intravital, se proporciona un protocolo para definir la cinética in vivo de + células madre / progenitoras osteogénicas Mx1 en la reparación de fracturas. Este protocolo ofrece imágenes secuenciales para seguir la reubicación de osteogénicas madre / progenitoras en los sitios de fractura y la medición cuantitativa de expansión osteoprogenitoras en el proceso de reparación temprana. Este enfoque puede ser útil en varios contextos, incluyendo la evaluación de candidatos terapéuticos para mejorar la reparación del hueso.
Protocol
Representative Results
Discussion
La regulación de las células madre del esqueleto puede ser de gran importancia para definir los mejores métodos para lograr la regeneración ósea. Imágenes cuantitativa y secuencial a nivel celular ha sido técnicamente difícil. Aunque el modelo de fractura de los huesos largos del ratón ha sido ampliamente utilizado y adecuado para estudios biomecánicos 17, su ubicación de tejido profundo, el tamaño de la fractura desigual, daño de tejidos blandos, y la aplicación de fijadores de estabilización …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a C. Park por leer el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el NIAMS en Número Award y un Premio K01AR061434 Leukemia & Lymphoma Society Fellowship (5127-09) para DP y subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud a CPL y DTS El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
References
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