Analysering proteasomalaktivitet Nedbrydning i en celle-fri system i planter
Summary
Målrettet protein nedbrydning udgør en stor reguleringsmekanisme for celle funktion. Det sker via en konserveret ubiquitinproteasomvejen, som lægger multiubiquitinkæder til målproteinet som derefter tjene som molekylære "tags" for 26S proteasom. Her beskriver vi en enkel og pålidelig cellefrit assay for proteasomalaktivitet nedbrydning af proteiner.
Abstract
Den ubiquitinproteasomvejen for proteinnedbrydning dukket op som en af de vigtigste mekanismer til regulering af et bredt spektrum af cellefunktioner i praktisk taget alle eukaryote organismer. Specifikt i planter, det ubiquitin/26S proteasom systemet (UPS) regulerer proteinnedbrydning og bidrager væsentligt til udviklingen af en lang række processer, herunder immunrespons, udvikling og programmeret celledød. Desuden øger tyder på, at mange plante-patogener, såsom Agrobacterium, udnytte værten UPS til effektiv infektion, understreger betydningen af UPS i plante-patogen interaktioner.
Underlaget specificitet UPS opnås ved E3 ubiquitinligase der handler i forståelse med E1 og E2 ligase til at genkende og markere bestemte proteinmolekyler bestemt til nedbrydning ved at knytte til dem kæder af ubiquitin-molekyler. En klasse af E3 ligaser er SCF (SKP1 / CUllin / F-box protein) kompleks, som specifikt genkender UPS substrater og målretter dem til ubiquitinering via sin F-box protein komponent. At undersøge en mulig rolle UPS i en biologisk proces af interesse, er det vigtigt at udvikle en enkel og pålidelig analyse for UPS-medieret proteinnedbrydning. Her beskriver vi en sådan assay under anvendelse af en plante cellefrit system. Denne analyse kan tilpasses til undersøgelser af roller reguleret protein nedbrydning i forskellige cellulære processer, med særlig fokus på F-box protein-substrat interaktioner.
Introduction
Den ubiquitin/26S proteasom vej fremstår som en udbredt mekanisme til styring af forskellige biologiske reaktioner, herunder transkriptionel regulering, cellecyklusfremadskriden og signaltransduktion, receptor nedregulering eller endocytose, blandt andre processer 1-4. I denne vej, er målproteinet tagget af ubiquitinenheder som først fastgjort via en thiolesterbinding til ubiquitin-aktiverende enzym E1 og derefter translokeres til en cystein aminosyrerest i ubiquitin-konjugation enzym E2, og endelig E2 interagerer med ubiquitin-ligase E3 , hvilket resulterer i polyubiquitination af proteinsubstratet. I sidste ende er de polyubiquitinated proteiner anerkendt og nedbrydes af 26S proteasomet. I denne mekanisme, E3 enzym angiver underlaget og fungerer som den centrale regulerende element i ubiquitin/26S proteasom systemet (UPS). E3 ligaser kan handle uafhængigt, såsom RING domæne ligaser, eller som del af en multisubunit SCF (Skp1/Cullin/F-box protein)-kompleks, såsom F-box domæne ligaser. SCF-medierede proteasomalaktivitet nedbrydningsveje er involveret i reguleringen af transskription, cellecyklus, signaltransduktion 5-10 og mange andre store cellulære funktioner.
Udover disse kritiske roller i reguleringen af cellulære processer, UPS tager den centrale scene i mange plante-patogen interaktioner. For eksempel flere beviser tyder på, at flere plante patogener, herunder Agrobacterium tumefaciens, stole på værten UPS for at lette infektionen processen 11.. Agrobacterium fremkalder neoplastiske vækster på planter, som repræsenterer dets naturlige værter, og det kan også omdanne en lang række andre eukaryoter, fra svampe 1,2 til humane celler 12,13. , Agrobacterium eksporterer løbet af sin infektion et DNA-element (T-DNA) og flere virulens (Vir) proteiner i værtscellen 12-13. Et af disse proteiner er VirF den første F-box-protein fundetat være kodet af en prokaryotisk genom 14. Som en del af SCF ubiquitinligase kompleks, VirF og dets funktionelle vært homolog VBF 15, lette Agrobacterium infektion via UPS-medieret proteinnedbrydning, hvilket formentlig letter virionkappe af invaderende bakterie T-DNA fra de ledsagende bakteriel og værtsproteiner, VirE2 og VIP1 henholdsvis 16,17. Interessant mange F-box proteiner, herunder VirF er uløseligt ustabile på grund af deres egen proteolyse, som medieres af autoubiquitination aktivitet 18,19 eller andre E3-ligaser, som F-box-proteiner kan tjene som substrater 20-23.
Når man studerer biokemiske aktiviteter F-box-proteiner, andre ubiquitin ligaser, og / eller deres substrater, ville det være meget nyttigt at anvende en enkel og pålidelig analyse for proteasomalaktivitet nedbrydning. Her beskriver vi en sådan protokol for analyse af protein stabilitet i en celle-Free system. I dette assay er stabiliteten af UPS substrat analyseret i nærvær eller fravær af en af de væsentlige dele af proteasomalaktivitet nedbrydningsvej, såsom en F-box-protein i et cellefrit system. Generelt udtrykker vi den testede protein (r) i plantevæv, forberede celle-fri ekstrakter fra disse væv og overvåge mængder af proteinet (r) af interesse ved western blotting. UPS-afhængige mekanisme af protein nedbrydning påvises ved inddragelse af specifikke proteasomalaktivitet hæmmere og / eller ved hjælp coexpression af dominant negativ form af en SCF-komponent, Cullin. Mens vi illustrere dette assay under anvendelse af proteasomalaktivitet nedbrydning af Arabidopsis VIP1 17 protein ved F-box-protein VBF 15, kan den anvendes til at undersøge stabiliteten af andre proteasomalaktivitet substrater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne analyse bygger på ekspressionen af de testede proteiner i plantevæv, og dermed den potentielle proteasomalaktivitet nedbrydningsprocessen naturligvis sker allerede inden for de levende væv. Vi assay protein destabilisering, dog kun i ekstrakterne med tiden nul prøve tjener som det første referencepunkt. Derfor har vi definere det som et cellefrit assay.
Et vigtigt aspekt for succes i dette assay er det korrekte valg af ekspressionsvektoren, hvorfra det testede protein (er) v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det arbejde, der fører til denne publikation har modtaget støtte fra Marie Curie COFUND program "U-mobilitet", medfinansieret af University of Malaga og Den Europæiske Union 7. rammeprogram (FP7/2007-2013) under GA nr. 246.550. Arbejdet i vores laboratorium er støttet af tilskud fra NIH, USDA / NIFA, NSF, Bard, og BSF til VC
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Ausobel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
