植物では無細胞系でプロテアソームによる分解をアッセイ
Summary
標的タンパク質分解は、細胞機能の主要な調節機構を表す。その後、26Sプロテアソームのために、分子「タグ」を提供する標的タンパク質にユビキチン鎖が付加し保存され、ユビキチン-プロテアソーム経路を介して行われます。ここでは、タンパク質のプロテアソーム分解のための、シンプルで信頼性の高い無細胞アッセイを記述します。
Abstract
タンパク質分解のためにユビキチン – プロテアソーム経路は、事実上すべての真核生物における細胞機能の広範囲の調節のための最も重要なメカニズムの一つとして浮上している。具体的には、植物において、ubiquitin/26Sプロテアソームシステム（UPS）は、タンパク質分解を調節し、免疫応答、発生およびプログラム細胞死のプロセスを含む広範囲の開発に大きく貢献する。また、増加する証拠は、 アグロバクテリウムなどの多数の植物病原体は、植物-病原体相互作用におけるUPSの重要性を強調し、効率的な感染のホストにUPSを利用することを示唆している。
UPSの基質特異性は、E1とE2と協調して作用するE3ユビキチンリガーゼによって達成されるそれらにユビキチン分子の鎖を結合することによって分解宛ての特定のタンパク質分子を認識し、マークするリガーゼ。 E3リガーゼの一つのクラスは、SCF（Skp1と/ Cです具体的にはUPS基質を認識し、F-boxタンパク質成分を介してユビキチン化のためにそれらを標的ウルリン/ F-ボックスタンパク質）錯体。関心対象の生物学的プロセスにおけるUPSの潜在的役割を調査するために、UPS媒介性タンパク質分解のためのシンプルで信頼性の高いアッセイを考案することが重要である。ここでは、植物、無細胞系を用いてそのようなアッセイを記載している。このアッセイは、F-boxタンパク質 – 基質相互作用に特に焦点を有する多様な細胞プロセスにおける調節タンパク質分解の役割の研究に適合させることができる。
Introduction
ubiquitin/26Sプロテアソーム経路は、転写調節、細胞周期の進行およびシグナル伝達、ダウンレギュレーションまたはエンドサイトーシス受容体、とりわけ1-4を処理するなど、多様な生物学的反応を制御するための広範な機構として浮上している。この経路において、標的タンパク質は、第ユビキチン活性化酵素E1にチオールエステル結合を介して結合し、次いで、ユビキチン共役酵素E2のシステインアミノ酸残基に転残基をユビキチンによりタグ付けされ、最後に、E2は、ユビキチンリガーゼE3と相互作用する、タンパク質基質のユビキチン化をもたらす。最終的には、ポリユビキチン化タンパク質は、26Sプロテアソームによって認識され、分解される。このメカニズムでは、E3酵素は、基質を指定し、ubiquitin/26Sプロテアソームシステム（UPS）の重要な調節コンポーネントとして機能します。 E3リガーゼは、RINGドメインリガーゼとして、またはマルチサブSCF（Sの一環として、独立して機能することができ例えば、F-boxドメインリガーゼとしてkp1/Cullin/F-boxタンパク質）複合体。 SCF媒介性プロテアソーム分解経路は、転写、細胞周期、シグナル伝達5-10および他の多くの主要な細胞機能の調節に関与している。
細胞過程の調節に、これらの重要な役割に加えて、UPSは多くの植物 – 病原体相互作用の中心的舞台になります。例えば、証拠が増えアグロバクテリウムツメファシエンスを含むいくつかの植物病原体は、感染プロセス11を容易にするためのホストのUPSに依存していることを示唆している。アグロバクテリウムは、その自然のホストを表す植物に腫瘍性増殖を誘発し、それはまた、ヒトの細胞12,13に菌類1,2から、他の真核生物の広い範囲を変換することができます。その感染時に、アグロバクテリウムは、宿主細胞12月13日にDNAエレメント（T-DNA）およびいくつかの病原性（Virの）タンパク質をエクスポートします。これらのタンパク質の一つがVirF、最初に検出されたF-boxタンパク質である原核生物のゲノム14によって符号化される。 SCFユビキチンリガーゼ複合体、VirF、及びその機能宿主ホモログVBF 15の一部として、おそらくVirE2、それに付随する細菌および宿主のタンパク質から侵入する細菌のT-DNAの脱殻を容易にUPS媒介性タンパク質分解を介して 、アグロバクテリウム感染を容易にするとVIP1、それぞれ16,17。興味深いことに、VirFを含む多くのF-ボックスタンパク質は、原因自己ユビキチン化活性の18,19によってまたはF-ボックスタンパク質は、基質20〜23として役立つ可能性があるため、他のE3リガーゼによって媒介される、独自のタンパク質分解に本質的に不安定である。
F-ボックスタンパク質、他のユビキチンリガーゼ、および/またはそれらの基質の生化学的活性を研究する場合には、プロテアソーム分解のためのシンプルで信頼性の高いアッセイを使用することは非常に有用であろう。ここで我々は、細胞中のタンパク質の安定性を分析するためのそのようなプロトコルの1つを記載フリーシステム。このアッセイでは、UPS基材の安定性は、無細胞系において、例えば、F-boxタンパク質としてのプロテアソーム分解経路の必須成分の一つの存在下又は非存在下で分析される。一般に、我々は、植物組織中で試験タンパク質を発現するこれらの組織からの無細胞抽出物を調製し、ウェスタンブロッティングによって、目的のタンパク質（単数または複数）の量を監視する。タンパク質分解のUPS依存性機構は、特定のプロテアソーム阻害剤および/またはSCF成分、キュリンのドミナントネガティブ型の同時発現を使用して含めることによって実証される。我々は、F-boxタンパク質VBF 15によって、シロイヌナズナVIP1 17タンパク質のプロテアソーム分解を用いてこのアッセイを例示する一方で、それは他のプロテアソーム基質の安定性を調べるために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このアッセイは、植物組織における試験したタンパク質の発現に依存しているため、潜在的なプロテアソーム分解プロセスは、明らかに、生体組織内で既に発生した。我々は、最初の基準点となる時間ゼロサンプルのみで、抽出物中で、しかし、タンパク質の不安定化をアッセイする。したがって、我々は、無細胞アッセイとして定義します。
このアッセイの成功のた?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この出版につながる仕事はジョージア番号246550の下でマラガ大学と欧州連合（EU）7 番目のフレームワークプログラム（FP7/2007-2013）によって協調融資マリーキュリーCOFUNDプログラム「U-モビリティ」から資金提供を受けています。私たちの研究室での作業はVCにNIH、米国農務省/ NIFA、NSF、バードとBSFからの補助金によってサポートされています
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Ausobel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
