Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante
Summary
Degradazione delle proteine mirata rappresenta un importante meccanismo di regolazione per la funzione delle cellule. Essa si verifica attraverso una via ubiquitina-proteasoma conservati, che attribuisce catene polyubiquitin alla proteina bersaglio che poi servire "tag" molecolari per il proteasoma 26S. Qui, descriviamo un saggio semplice e affidabile senza cellula per proteasoma degradazione delle proteine.
Abstract
Il pathway ubiquitina-proteasoma per la degradazione delle proteine è emerso come uno dei meccanismi più importanti per la regolazione di un ampio spettro di funzioni cellulari in quasi tutti gli organismi eucarioti. In particolare, nelle piante, il sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regola la degradazione delle proteine e contribuisce significativamente allo sviluppo di una vasta gamma di processi, compresa la risposta immunitaria, lo sviluppo e la morte cellulare programmata. Inoltre, sempre più evidenze suggeriscono che numerosi agenti patogeni delle piante, quali Agrobacterium, sfruttano l'UPS di accoglienza per l'infezione efficiente, sottolineando l'importanza della continuità nelle interazioni pianta-patogeno.
La specificità di substrato della UPS è raggiunto dalla ubiquitina ligasi E3 che agisce di concerto con la E1 e E2 ligasi di riconoscere e marcare molecole proteiche specifici destinati a degradazione da dandole catene di molecole di ubiquitina. Una classe delle ligasi E3 è la SCF (Skp1 / Cproteina Ullin / F-box) complessa, che riconosce specificamente i substrati UPS e obiettivi per l'ubiquitinazione attraverso la sua componente proteica F-box. Per studiare il ruolo potenziale di UPS in un processo biologico di interesse, è importante mettere a punto un saggio semplice e affidabile per degradazione proteica UPS-mediata. Qui, descriviamo un tale saggio usando un sistema acellulare pianta. Questo test può essere adattato per lo studio dei ruoli di degradazione delle proteine regolamentato in diversi processi cellulari, con un focus particolare sulle interazioni proteina-substrato F-box.
Introduction
Il proteasoma percorso ubiquitin/26S sta emergendo come un meccanismo diffuso per il controllo di diverse reazioni biologiche, tra cui regolazione trascrizionale, la progressione del ciclo cellulare e trasduzione del segnale, recettori down-regulation o endocitosi, tra gli altri processi 1-4. In questo percorso, la proteina bersaglio viene etichettato da ubiquitina residui che vengono prima collegati tramite un legame thiolester to-ubiquitina attivando l'enzima E1 e poi traslocato a un residuo di acido cisteina amino ubiquitina-coniugazione enzima E2, infine, E2 interagisce con ubiquitina ligasi E3 , con conseguente polyubiquitination del substrato proteico. In definitiva, le proteine polyubiquitinated sono riconosciuti e degradati dal proteasoma 26S. In questo meccanismo, l'enzima E3 specifica il substrato e funge da elemento regolatore chiave del sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS). Ligasi E3 possono agire in modo indipendente, come ligases dominio RING, o come parte di un SCF multisubunit (S) complesso proteico kp1/Cullin/F-box, come ad esempio F-box ligases dominio. SCF-mediate vie di degradazione del proteasoma sono coinvolti nella regolazione della trascrizione, ciclo cellulare, la trasduzione del segnale 5-10 e molte altre importanti funzioni cellulari.
Oltre a questi ruoli critici nella regolazione dei processi cellulari, UPS prende il palco centrale in molte interazioni pianta-patogeno. Ad esempio, una crescente evidenza suggerisce che diversi agenti patogeni delle piante, tra cui Agrobacterium tumefaciens, si basano su l'UPS host per per facilitare il processo di infezione 11. Agrobacterium provoca escrescenze neoplastiche sulle piante, che rappresentano i suoi ospiti naturali, e può anche trasformare una vasta gamma di altri eucarioti, da funghi 1,2 a cellule umane 12,13. Durante la sua infezione, Agrobacterium esporta un elemento DNA (T-DNA) e vari virulenza (vir) proteine nella cellula ospite 12-13. Una di queste proteine è VirF, la prima proteina F-box trovatiessere codificati da un genoma procariotico 14. Come parte del complesso SCF ubiquitina ligasi, VirF, e il suo omologo ospitante funzionale VBF 15, facilitare infezione Agrobacterium tramite la degradazione delle proteine UPS-mediata, che facilita presumibilmente uncoating del invadere batterica T-DNA dalle proteine batteriche e ospitanti accompagnamento, VirE2 e VIP1 rispettivamente 16,17. È interessante notare che molte proteine F-box, tra cui VirF, sono intrinsecamente instabili a causa della loro proteolisi, che è mediata da attività autoubiquitination 18,19 o da altri ligasi E3 per i quali le proteine F-box possono fungere da substrati 20-23.
Quando si studia attività biochimiche delle proteine F-box, altri ligasi ubiquitina, e / o le loro substrati, sarebbe molto utile un test semplice e affidabile per la degradazione del proteasoma. Qui si descrive un tale protocollo per analizzare la stabilità della proteina in una cellula-Libero Sistema. In questo saggio, la stabilità del substrato UPS viene analizzato in presenza o assenza di uno dei componenti essenziali del percorso di degradazione proteasoma, come una proteina F-box, in un sistema acellulare. In generale, esprimiamo la proteina (s) testato in tessuti vegetali, preparare estratti privi di cellule di questi tessuti e monitorare la quantità di proteina (s) di interesse mediante western blotting. Il meccanismo UPS-dipendente di degradazione proteica è dimostrata dalla inclusione di inibitori del proteasoma specifici e / o tramite coespressione di forma dominante negativa di un componente SCF, Cullin. Considerando che illustriamo questo dosaggio utilizzando proteasoma degradazione della proteina Arabidopsis VIP1 17 dalla proteina F-box VBF 15, può essere impiegato per studiare la stabilità di eventuali altri substrati del proteasoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo test si basa sulla espressione delle proteine testati in tessuti vegetali, quindi, il potenziale processo di degradazione proteasoma avviene ovviamente già all'interno dei tessuti viventi. Abbiamo protein assay destabilizzazione, tuttavia, solo negli estratti, con il tempo di campionamento di zero che serve come punto di riferimento iniziale. Quindi, definiamo come un saggio privo di cellule.
Un aspetto importante per il successo di questo test è la corretta scelta del vet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro portato a questa pubblicazione ha ricevuto finanziamenti dal programma Marie Curie COFUND "U-Mobility", cofinanziato dall'Università di Malaga e il programma dell'Unione europea 7 ° programma quadro (FP7/2007-2013) sotto GA No. 246550. Il lavoro nel nostro laboratorio è sostenuto da sovvenzioni dal NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, e BSF a VC
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
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