Live-Imaging mitosens i udviklingslandene mus embryonale Cortex
Summary
Neural progenitor mitose er en kritisk parameter for neurogenese. Meget af vores forståelse af neurale stamfader mitose er baseret på analyse af fast væv. Levende billeddannelse i embryonale hjernen skiver er en alsidig teknik til at vurdere mitose med høj tidslig og rumlig opløsning i et kontrolleret miljø.
Abstract
Skønt af kort varighed, mitose er et komplekst og dynamisk multi-trins proces grundlæggende for udvikling af organer, herunder hjernen. I udviklingslandene hjernebarken kan unormal mitose af neurale progenitorer forårsage defekter i hjernens størrelse og funktion. Der er derfor et kritisk behov for værktøjer til at forstå de mekanismer, neural stamcelle mitose. Cortical udvikling i gnavere er en fremragende model til at studere denne proces. Neural progenitor mitose er almindeligt undersøgt i faste hjernesnit. Denne protokol vil beskrive i detaljer en metode til billeddannelse af mitose i ex vivo embryonale hjernen skiver. Vi vil beskrive de kritiske trin for denne procedure, som omfatter: hjerne udvinding, hjerne indlejring, vibratome sektionering af hjernen skiver, farvning og dyrkning af skiver, og time-lapse billeddannelse. Vi vil derefter vise og beskrive i detaljer, hvordan at udføre post-erhvervelse analyse af mitose. Vi inkluderer repræsentative resultater frabout denne analyse ved hjælp af vital farvestof Syto11, transgene mus (histon H2B-EGFP og centrin-EGFP), og i livmoderen elektroporation (mCherry-α-tubulin). Vi vil diskutere, hvordan denne procedure kan bedst optimeres, og hvordan den kan modificeres til undersøgelse af genetisk regulering af mitose. Levende billeder af mitose i hjernen skiver er en fleksibel tilgang til at vurdere virkningen af alder, anatomi, og genetisk forstyrrelse i et kontrolleret miljø, og for at skabe en stor mængde data med høj tidslig og rumlig opløsning. Derfor denne protokol skal supplere de eksisterende redskaber til analyse af neurale stamfader mitose.
Introduction
Det overordnede mål med denne protokol er at beskrive, hvordan at optræde live billeddannelse af neurale stamfader mitose i embryonale hjernen skiver. Brug af levende billeddannelse af hjernen skiver i kultur, denne protokol giver en enkel metode til at analysere flere aspekter af mitose i neurale stamfædre i et miljø meget lig en in vivo indstilling. Det kan anvendes til hjerner af mutante dyr og / eller hjerner, der er blevet manipuleret med i utero elektroporation) 1-5. Denne teknik er også ideel til at teste virkningen af farmakologiske midler på neurale prækursorer "mitose ved blot at tilføje et middel til dyrkningsmediet. I summen, vil denne artikel lave en teknisk udfordrende protokol tilgængelig for dem, der studerer neurogenesis.
Under neurogenese, adskilte neurale progenitorpopulationer gennemgå præcise divisioner til at generere neuroner, der i sidste ende bidrager til de seks kortikale lag af voksen neocortex 6-8. Tidligt i kortikale udvikling, den neurale forløber pulje udvider som neuroepitelceller (NE) celler deler symmetrisk til selv at forny. NE celler derefter konvertere til radiale gliaceller (rGCS). Oprindeligt rGCS opdele symmetrisk at producere to nye rGCS dog under hovedparten af neurogenese, rGCS 'vigtigste form for opdeling er asymmetrisk. I asymmetrisk opdeling, 1 RGC giver anledning til en ny RGC og enten en post-mitotisk neuron eller en mere specialiseret progenitor (enten en kort neural precursor (SNP), en ydre radial glia (ORG), eller et mellemprodukt progenitor (INP) 2,3,7,9. natur-, SNP'er og ORGS kan derefter generere neuroner på sub-ventrikulær, ventrikulær og basale regioner af hjernebarken, hhv. Derfor celledeling progenitorer er en grundlæggende fremgangsmåde til at generere neuroner i neocortex.
Talrige undersøgelser peger på en sammenhæng mellem specifikke mitotiske træk rGCS og skæbne datterceller. Haydar et al. Og Takahashi et al.har vist, at RGC mitotisk varighed og cellecyklus længde stigning som neurogenese provenu, en konstatering genlyd i opfølgende undersøgelser 10-13. En række undersøgelser har antydet, at mitotiske spindel-orientering i forhold til hjertekammer påvirker aspekter af neurogenese og corticogenesis, herunder typer af neuroner genererede og placering af afkom i hjernen, henholdsvis 3,10,14-16. Uanset om spaltning plane orientering direkte indflydelse celle skæbne er kontroversiel, men konklusionen er, at denne mitotiske parameter påvirkninger neurogenesis. Yderligere understrege vigtigheden i mitosen er den iagttagelse, at mange gener involveret i mekanikken i mitosen er afgørende for neurogenese og for korrekt hjernens udvikling 17-20.
Mitose er en dynamisk proces, men til dato de fleste undersøgelser beskriver neurale stamfader mitose udnytte analyse af faste vævssnit eller billeddannelse af neurale stamfædre via in vitro-cellekultur. Således mainstream metoder til at evaluere mitose kun give et øjebliksbillede af denne proces, og undlader at afdække, hvordan celler opfører sig på en væv. Live-billeddannelse af neurale stamfader mitose i stigende grad blevet et afgørende redskab til at forstå neurale stamfader funktion. For eksempler se disse referencer 4,8,10,21-25. Flere udestående protokoller er blevet offentliggjort til forberedelse og billeddannelse af hjernen skiver 26,27. Men til dato har en omfattende protokol for billedbehandling og analyse af mitose ikke beskrevet eller demonstreret i video.
Denne teknik giver flere væsentlige fordele i forhold fast analyse af hjernens sektioner. Time-lapse-analyse af hjernen skiver muliggør generering af betydeligt flere datapunkter, der kan analyseres på en fleksibel måde. For det første er data indsamlet på de enkelte tidspunkter i løbet af nogle minutter eller flere timer. Man kan analysere de enkelte tidspunkter (at oprette et statisk montage) ellerkan kombinere forskellige tidspunkter i film. For det andet, konfokal imaging skiver muliggør generering af data på forskellige Z-profiler i hjernen skiver. Som et resultat heraf kan de enkelte sektioner analyseres. Alternativt kan stakke af individuelle sektioner kombineres til en maksimal intensitet projektion. For det tredje analyse udført i forbindelse med et væv, der afslører, hvordan celler deler i forhold til de omkringliggende celler og strukturer. For det fjerde er det ideelt til analyse af mutanter, der viser nogle beviser for mitotiske defekter. Sammen denne protokol vil bidrage til at afklare vigtige skridt til at hjælpe efterforskere, der ønsker at udføre levende billeddannelse af neurale stamfader mitose i deres egne laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den største fordel ved protokollen vi har beskrevet, at det giver en dynamisk tidsmæssige opløsning i mitosen af neurale stamceller. Typisk er assays at visualisere mitose i hjernens udvikling udført ved hjælp immunfluorescens af faste vævssnit. Men denne tilgang kun giver et øjebliksbillede af mitose på et tidspunkt.
Der er flere trin, der er mest kritiske for billeddannelse mitose i hjernen skiver: 1) De hjernen skiver skal forblive fastgjort til agarose, for at bevare integr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkender finansiering fra NINDS / NIH, R00-NS064197 og NINDS / NIH, R01NS083897 (både DLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
