La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.
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Artículo de método
Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón
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Resumen
Resumen
Aunque de corta duración, la mitosis es un proceso de múltiples pasos complejo y dinámico fundamental para el desarrollo de órganos, incluyendo el cerebro. En la corteza cerebral en desarrollo, la mitosis anormal de progenitores neurales puede causar defectos en tamaño y la función del cerebro. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de herramientas para entender los mecanismos de la mitosis progenitora neural. Desarrollo cortical en los roedores es un modelo excelente para el estudio de este proceso. La mitosis progenitoras neurales se examina comúnmente en las secciones del cerebro fijos. Este protocolo se describen en detalle un enfoque para la formación de imágenes en directo de la mitosis en ex vivo rodajas de cerebro de embriones. Vamos a describir los pasos críticos para este procedimiento, que incluyen: la extracción del cerebro, la incrustación de cerebro, vibratome seccionamiento de cortes de cerebro, la tinción y el cultivo de las rebanadas, y time-lapse. A continuación, vamos a demostrar y describir en detalle cómo realizar el análisis posterior a la adquisición de la mitosis. Incluimos resultados representativos frOM este ensayo usando el colorante vital Syto11, ratones transgénicos (histona H2B-EGFP y EGFP-centrin), y en el útero de electroporación (mCherry-α-tubulina). Vamos a discutir cómo se puede optimizar mejor este procedimiento y la forma en que se puede modificar para el estudio de la regulación genética de la mitosis. Imágenes en vivo de la mitosis en rodajas de cerebro es un enfoque flexible para evaluar el impacto de la edad, la anatomía y la perturbación genética en un ambiente controlado, y para generar una gran cantidad de datos con una alta resolución temporal y espacial. De ahí que este protocolo complementa las herramientas existentes para el análisis de la mitosis progenitoras neurales.
Introducción
El objetivo general de este protocolo es describir cómo realizar imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales en rodajas de cerebro de embriones. El uso de imágenes en vivo de cortes de cerebro en cultivo, este protocolo proporciona un método simple para ensayar múltiples aspectos de la mitosis en células progenitoras neurales en un entorno altamente similar a un entorno in vivo. Se puede aplicar a los cerebros de los animales y / o cerebros mutantes que han sido manipulados con la electroporación en el útero) 1-5. Esta técnica también es ideal para probar el efecto de agentes farmacológicos en la mitosis precursores neuronales &#....
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Protocolo
1. Preparación de Medios (figura 1, paso 1)
- Slice Medio de Cultivo
- 25 ml de medio de cultivo rebanada es suficiente para preparar platos de fondo 5 de vidrio con 2 rebanadas por pocillo.
- En un tubo cónico de 50 ml, añadir 250 l de una solución de N2 100x y 500 l de una solución 50x B27 sin vitamina A. Añadir DMEM/F12 a un volumen de 22,5 ml.
- Filtro de esterilizar la solución y, posteriormente, añadir 1,25 ml de suero de caballo inactivado por calor y 1,25 ml de suero fetal bovino.
- Incubar solución en un baño de agua a 37 ° C durante la duración de la preparación de las rodajas.
- Añadir los factores de crecimi....
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Resultados
El éxito de este ensayo y la observación de múltiples células mitóticas durante una sesión de formación de imágenes en vivo dependen en gran medida de tanto la integridad y nivel anatómico de la rebanada de donde se toman las adquisiciones. Como veremos más adelante, el nivel anatómico de un sector es un factor importante. Figura 3A muestra rostro-caudal y medial-lateral lugares en los que hemos tenido más éxito. Para la discusión adicional de este tema consulte Noctor 26. La integridad de la.......
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Discusión
La principal ventaja del protocolo que hemos descrito es que proporciona una resolución temporal dinámica de la mitosis de células progenitoras neurales. Por lo general, los ensayos de visualizar la mitosis en el cerebro en desarrollo se realizan utilizando inmunofluorescencia de secciones de tejido fijadas. Pero este enfoque sólo ofrece una instantánea de la mitosis en un punto del tiempo.
Hay varios pasos que son más críticos para obtener imágenes de mitosis en rodajas de cerebro: 1) Los c.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores agradecen la financiación de NINDS / NIH, R00-NS064197 y NINDS / NIH, R01NS083897 (tanto para DLS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | para medio de cultivo |
| 50X B27 sin vitamina A | Life technologies | 12587010 | para medio de cultivo |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | para medio |
| de cultivo Suero de caballo inactivado por calor | Sigma Aldrich | H1138-500ml | para medio |
| de cultivo Suero de ternera inactivado por calor | Sigma Aldrich | F4135-500ML | para medio de cultivo |
| FGF | R& D Sytems | 3139-FB-025 | para medio de cultivo |
| EGF | para medio de cultivo | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | para la disección de los embriones |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | diluido a 1 M (pH 7,4) |
| 2,5 M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | para la disección de los embriones |
| 0,9 M NaHCO3 | Life technologies | 25080-094 | para la disección de los embriones |
| Agarosa de bajo punto de fusión | Fisher | BP165-25 | para la generación de rodajas |
| Syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µ l alícuotas |
| 3 mg/ml colágeno tipo I | Life technologies | A1048301 | para el cultivo de rodajas |
| Plato con fondo de vidrio | MatTek | P35G-1.5-14-C | para el cultivo de rodajas Placas |
| Petri | para la disección de los embriones | ||
| Termómetro | para medir la temperatura de la agarosa | ||
| Espátula | para Transferencia de cerebros | ||
| Pincel | alternativo a los cerebros de transferencia | ||
| Vibratome | Leica | VT1000s | para generar rebanadas |
| Microscopio | de disección Diseccionar embriones | ||
| Microscopio | Se requiere un microscopio confocal, debe estar equipado con una cámara de incubación |
Referencias
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F.
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Reimpresiones y permisos
