Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón
Summary
La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.
Abstract
Aunque de corta duración, la mitosis es un proceso de múltiples pasos complejo y dinámico fundamental para el desarrollo de órganos, incluyendo el cerebro. En la corteza cerebral en desarrollo, la mitosis anormal de progenitores neurales puede causar defectos en tamaño y la función del cerebro. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de herramientas para entender los mecanismos de la mitosis progenitora neural. Desarrollo cortical en los roedores es un modelo excelente para el estudio de este proceso. La mitosis progenitoras neurales se examina comúnmente en las secciones del cerebro fijos. Este protocolo se describen en detalle un enfoque para la formación de imágenes en directo de la mitosis en ex vivo rodajas de cerebro de embriones. Vamos a describir los pasos críticos para este procedimiento, que incluyen: la extracción del cerebro, la incrustación de cerebro, vibratome seccionamiento de cortes de cerebro, la tinción y el cultivo de las rebanadas, y time-lapse. A continuación, vamos a demostrar y describir en detalle cómo realizar el análisis posterior a la adquisición de la mitosis. Incluimos resultados representativos frOM este ensayo usando el colorante vital Syto11, ratones transgénicos (histona H2B-EGFP y EGFP-centrin), y en el útero de electroporación (mCherry-α-tubulina). Vamos a discutir cómo se puede optimizar mejor este procedimiento y la forma en que se puede modificar para el estudio de la regulación genética de la mitosis. Imágenes en vivo de la mitosis en rodajas de cerebro es un enfoque flexible para evaluar el impacto de la edad, la anatomía y la perturbación genética en un ambiente controlado, y para generar una gran cantidad de datos con una alta resolución temporal y espacial. De ahí que este protocolo complementa las herramientas existentes para el análisis de la mitosis progenitoras neurales.
Introduction
El objetivo general de este protocolo es describir cómo realizar imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales en rodajas de cerebro de embriones. El uso de imágenes en vivo de cortes de cerebro en cultivo, este protocolo proporciona un método simple para ensayar múltiples aspectos de la mitosis en células progenitoras neurales en un entorno altamente similar a un entorno in vivo. Se puede aplicar a los cerebros de los animales y / o cerebros mutantes que han sido manipulados con la electroporación en el útero) 1-5. Esta técnica también es ideal para probar el efecto de agentes farmacológicos en la mitosis precursores neuronales ', por la simple adición de un agente al medio de cultivo. En suma, este artículo hará un protocolo técnicamente difícil acceso para los que estudian la neurogénesis.
Durante la neurogénesis, poblaciones progenitoras neuronales distintas someten a divisiones precisas para generar neuronas que finalmente contribuyen a las seis capas corticales del neocórtex 6-8 adultos. Temprano en el desarrollo cortical, la piscina precursor neuronal se expande como células neuroepiteliales (NE) se dividen simétricamente de auto-renovación. Células NE a continuación, se convierten en células gliales radiales (CGR). Inicialmente CGR división simétrica para producir dos nuevos CGR, sin embargo, durante la mayor parte de la neurogénesis, el modo principal CGR 'de la división es asimétrica. En la división asimétrica, 1 RGC da lugar a un nuevo RGC y, o bien una neurona post-mitótico, o un progenitor más especializado (ya sea un precursor neuronal corto (SNP), un glía radial exterior (ORG), o un progenitor intermedio (INP) 2,3,7,9. INP, SNPs, y orgs luego pueden generar neuronas en el sub-ventricular, ventricular, y las regiones basales de la corteza, respectivamente. Por lo tanto, la división celular de los progenitores es un proceso fundamental para la generación de neuronas de la neocórtex.
Numerosos estudios apuntan a una correlación entre los rasgos mitóticas específicas de la CGR y el destino de las células hijas. Haydar et al., Y Takahashi et al.han demostrado que la RGC duración mitótico y aumento de la duración del ciclo celular como neurogénesis continúa, un hallazgo se hizo eco en el seguimiento de los estudios de 10 a 13. Un número de estudios han sugerido que huso mitótico orientación relativa al ventrículo influye en los aspectos de la neurogénesis y corticogenesis, incluyendo tipos de neuronas generadas y ubicación de la progenie en el cerebro, respectivamente 3,10,14-16. Si la orientación plano de clivaje influye directamente en el destino celular es controversial, pero la conclusión es que este mitótico impactos parámetros neurogénesis. Subraya además la importancia de la mitosis es la observación de que muchos genes implicados en la mecánica de la mitosis son cruciales para la neurogénesis y para el desarrollo adecuado del cerebro 17-20.
La mitosis es un proceso dinámico, sin embargo, hasta la fecha la mayoría de los estudios que detallan la mitosis progenitora neural utilizar el análisis de secciones de tejido de imágenes fijas o de progenitores neurales a través de cultivo celular in vitro. Por lo tanto, los métodos convencionales para evaluar la mitosis sólo proporcionan una instantánea de este proceso y no logran descubrir cómo se comportan las células en un tejido. Imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales se ha convertido en una herramienta fundamental para la comprensión de la función de progenitores neurales. Para ejemplos vea estas referencias 4,8,10,21-25. Varios protocolos pendientes se han publicado para la preparación y obtención de imágenes de cortes de cerebro 26,27. Sin embargo hasta la fecha, un protocolo completo para la formación de imágenes y el análisis de la mitosis no se ha descrito ni demostrado en vídeo.
Esta técnica ofrece varias ventajas significativas sobre análisis fija de secciones de cerebro. Time-lapse análisis de cortes de cerebro permite la generación de un número significativamente mayor de puntos de datos que pueden ser analizados de una manera flexible. En primer lugar, los datos se reunieron en puntos de tiempo individuales en el transcurso de varios minutos o varias horas. Uno puede analizar los puntos temporales individuales (para crear un montaje estático) opueden combinar diferentes puntos de tiempo en películas. En segundo lugar, la imagen confocal de rebanadas permite la generación de los datos en diferentes secciones Z en rodajas de cerebro. Como resultado, las secciones individuales se pueden analizar. Alternativamente, las pilas de secciones individuales se pueden combinar en una proyección de intensidad máxima. En tercer lugar, el análisis se realiza en el contexto de un tejido, que revela cómo las células se dividen con respecto a las células y estructuras vecinas. En cuarto lugar, es ideal para el análisis de mutantes que muestran alguna evidencia de defectos mitótico. Juntos este protocolo ayudará a clarificar los pasos críticos para ayudar a los investigadores que deseen realizar imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales en sus propios laboratorios.
Protocol
Representative Results
Discussion
La principal ventaja del protocolo que hemos descrito es que proporciona una resolución temporal dinámica de la mitosis de células progenitoras neurales. Por lo general, los ensayos de visualizar la mitosis en el cerebro en desarrollo se realizan utilizando inmunofluorescencia de secciones de tejido fijadas. Pero este enfoque sólo ofrece una instantánea de la mitosis en un punto del tiempo.
Hay varios pasos que son más críticos para obtener imágenes de mitosis en rodajas de cerebro: …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen la financiación de NINDS / NIH, R00-NS064197 y NINDS / NIH, R01NS083897 (tanto para DLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
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