Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex
Summary
Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.
Abstract
Hoewel korte duur, mitose is een complexe en dynamische meerstapsproces fundamenteel belang voor de ontwikkeling van organen zoals de hersenen. In de ontwikkeling van cerebrale cortex, kan abnormale celdeling van neurale voorlopercellen defecten veroorzaken in de hersenen omvang en functie. Daarom is er dringend behoefte aan tools om de mechanismen van neurale voorlopercellen mitose begrijpen. De corticale ontwikkeling bij knaagdieren is een uitstekend model voor het bestuderen van dit proces. Neurale voorlopercellen mitose wordt vaak in vaste hersenen secties onderzocht. Dit protocol zal in detail beschrijven een aanpak voor live-beeldvorming van mitose in ex vivo embryonale hersenen plakjes. We zullen de kritische stappen beschrijven voor deze procedure, waaronder: hersenen extractie, hersenen inbedding, vibratome snijden van de hersenen plakjes, kleuring en kweken van plakjes, en time-lapse imaging. Wij zullen dan laten zien en beschrijf in detail hoe na de overname analyse van mitose te voeren. We zijn onder andere representatieve resultaten frOM deze test met de vitale kleurstof Syto11 transgene muizen (histon H2B-EGFP en Centrin-EGFP) en in utero elektroporatie (mCherry-α-tubuline). We zullen bespreken hoe deze procedure het beste kan worden geoptimaliseerd en hoe het kan worden aangepast voor onderzoek naar genetische regulatie van de mitose. Live-beeldvorming van mitose in de hersenen plakjes is een flexibele benadering van de invloed van leeftijd, anatomie, en genetische verstoring in een gecontroleerde omgeving te beoordelen, en een grote hoeveelheid gegevens met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie te genereren. Vandaar dit protocol zal de bestaande instrumenten voor de analyse van neurale voorlopercellen mitose.
Introduction
De algemene doelstelling van dit protocol is om te beschrijven hoe om live beeldvorming van neurale voorlopercellen mitose presteren in embryonale hersenen plakjes. Met behulp van live beeldvorming van de hersenen plakjes in de cultuur, dit protocol voorziet in een eenvoudige methode om meerdere aspecten van de mitose assay in neurale voorlopercellen in een omgeving die sterk lijkt op een in vivo setting. Het kan worden toegepast op hersenen van mutante dieren en / of hersenen die zijn gemanipuleerd met in utero elektroporatie) 1-5. Deze techniek is ook ideaal om het effect van farmacologische middelen op mitose neurale precursoren te testen, door eenvoudig toevoegen van een middel aan het kweekmedium. Kortom, zal dit artikel een technisch uitdagende protocol toegankelijk voor diegenen studeren neurogenese te maken.
Tijdens neurogenese onderscheiden neurale populaties ondergaan nauwkeurig divisies neuronen die uiteindelijk bijdragen aan de zes corticale lagen van de volwassen neocortex 6-8 genereren. Vroeg in de corticale ontwikkeling, de neurale voorloper zwembad uitzet als neuro (NE) cellen delen symmetrisch om zichzelf te vernieuwen. NE cellen vervolgens omzetten in radiale gliacellen (RGC). Aanvankelijk RGC verdelen symmetrisch twee nieuwe RGC produceren, maar tijdens het grootste deel van neurogenese, belangrijkste wijze van verdeling RGC 'is asymmetrisch. In asymmetrische verdeling, 1 RGC ontstaat een nieuwe RGC en ofwel een post-mitotische neuron, of een meer gespecialiseerde voorlopercellen (een korte neurale precursor (SNP), een buitenste radiale glia (ORG), of een tussenproduct progenitor (INP) 2,3,7,9. INPS SNPs en ORGs kan vervolgens genereren neuronen in het sub-ventriculaire, ventriculaire en basale gebieden van de cortex, respectievelijk. Daarom celdeling voorlopercellen is een fundamenteel proces voor het genereren van neuronen van de neocortex.
Talrijke studies wijzen op een verband tussen specifieke mitotische trekken van RGC en het lot van dochtercellen. Haydar et al.. En Takahashi et al..hebben aangetoond dat de RGC mitotische duur en lengte van de celcyclus toename als neurogenese opbrengst, een bevinding weerklinkt in de follow-up studies 10-13. Een aantal studies hebben gesuggereerd dat mitotische spindel oriëntatie ten opzichte van het ventrikel beïnvloedt aspecten van neurogenese en corticogenesis, met inbegrip van soorten neuronen gegenereerd en de locatie van nakomelingen in de hersenen, respectievelijk 3,10,14-16. Of splijtenvliegtuig oriëntatie beïnvloedt direct cellot is controversieel, maar de conclusie blijft dat deze mitotische parameter gevolgen neurogenese. Verder benadrukken van het belang van mitose is de constatering dat vele genen betrokken bij de mechanica van mitose zijn cruciaal voor neurogenese en voor een goede ontwikkeling van de hersenen 17-20.
Mitose is een dynamisch proces, maar tot op heden de meeste onderzoeken waarin progenitorceltransplanten mitose gebruiken analyse van vaste weefselsecties of beeldvorming van neurale voorlopercellen via in vitro celkweek. Dus de reguliere methoden mitose evalueren slechts een momentopname van dit proces en niet te ontdekken hoe cellen zich in een weefsel. Live-beeldvorming van neurale voorlopercellen mitose is steeds meer een instrument van cruciaal belang voor het begrijpen van neurale voorlopercellen functie. Voor voorbeelden zie deze referenties 4,8,10,21-25. Diverse openstaande protocollen zijn gepubliceerd voor de voorbereiding en beeldvorming van de hersenen plakjes 26,27. Maar tot op heden heeft een uitgebreid protocol voor beeldvorming en analyse van de mitose niet beschreven noch aangetoond in video.
Deze techniek biedt een aantal belangrijke voordelen boven vaste analyse van hersencoupes. Time-lapse analyse van de hersenen plakjes schakelt het maken van aanzienlijk meer datapunten die op een flexibele manier kan worden geanalyseerd. Eerst worden gegevens verzameld op afzonderlijke tijdstippen in de loop van enkele minuten of enkele uren. Men kan sommige tijdstippen (om een statische montage te maken) of analyserenkunnen verschillende tijdstippen te combineren in films. Ten tweede, confocale beeldvorming van plakjes schakelt het maken van de gegevens op verschillende Z-profielen in de hersenen plakjes. Hierdoor kunnen afzonderlijke secties worden geanalyseerd. Alternatief kan stapels individuele secties worden gecombineerd tot een maximale intensiteit projectie. Ten derde wordt de analyse uitgevoerd in de context van een weefsel, onthullen hoe cellen verdelen ten opzichte van naburige cellen en structuren. Ten vierde is het ideaal geschikt voor analyse van mutanten dat enige mitotische afwijkingen vertonen. Samen dit protocol zal helpen verduidelijken kritische stappen aan onderzoekers die wensen om live beeldvorming van neurale voorlopercellen mitose voeren in hun eigen laboratoria te helpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het grote voordeel van het protocol we hebben beschreven dat het een dynamische temporele resolutie van mitose van neurale voorlopercellen. Gewoonlijk assays mitose visualiseren in de ontwikkelende hersenen worden uitgevoerd met behulp van immunofluorescentie vaste weefselsecties. Maar deze aanpak geeft slechts een momentopname van de mitose op een tijdstip.
Er zijn verschillende stappen die het meest essentieel voor het afbeelden van mitose in hersenenplakken: 1) De hersenen plakjes moet bl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen financiering van NINDS / NIH, R00-NS064197 en NINDS / NIH, R01NS083897 (zowel voor DLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
