G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용
Summary
광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다.
Abstract
이온 채널을 선택적으로 이온이 플라즈마 막 (1)을 통해 흐르게함으로써 뉴런 및 다른 흥분성 세포 유형의 전기적 특성을 제어한다. 신경 세포의 흥분성을 조절하기 위해, 이온 채널의 생물 리 학적 특성은 종종 이종 체 채널 착물 2,3을 형성하는 채널 자체에 바인딩 신호 단백질 및 분자에 의해 수정된다. 살아있는 세포에서의 상호 작용의 시간 경과에 적은 정보를 제공하면서 채널 및 규정 단백질 사이의 상호 작용을 조사 전통적인 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수 외인성 라벨을 필요로한다. 이러한 X-BODY 생명 과학 BIND 스캐너 시스템과 광 바이오 센서는, 공명의 변화를 감지하는, 새로운 라벨이없는 기술, 공진 파장 격자 (RWG) 광 바이오 센서를 사용하는 바이오 센서 주변의 빛을 반영합니다. 이 분석은 허용 상대 검출세포 접착의 리간드 유도 변화 확산 독성, 증식 및 세포막 근처 단백질 – 단백질 상호 작용의 변화로 인해 발생하는 바이오 센서의 표면에 부착 한 생세포의 바닥 부 내에 질량 변화. RWG 광 바이오 센서는 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에), 수용체 티로신 키나아제, 및 다른 세포 표면 수용체의 활성화 다음 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지하기 위해 사용되어왔다. 이온 채널 단백질 상호 작용의 리간드에 의한 변화는이 분석을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 이 논문에서, 우리는 한산한-B 나트륨 활성화 칼륨 GPCR에 의해 (K 나) 채널의 변조를 감지하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다.
Introduction
생리 학적으로 중요한 상황에서 살아있는 세포를 검사하는 표적 세포의 생물학적 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 채널과 같은 coimmunoprecipitation 분석법 규제 세포질 단백질 사이의 상호 작용을 조사 분석법은 일반적으로 살아있는 세포의 상호 작용의 시간 경과에 약간의 정보를 제공한다. 현재 셀 기반 분석의 대부분은 그 찬란 태그 단백질의 전위와 같은 특정 세포 이벤트를 측정합니다. 이러한 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수있다 또한 단백질의 변형을 요구한다. 시스템의 조작을 필요로 세포 활동의 연속 측정을 제공하고 그들의 가장 생리 학적으로 관련 국가 4 세포의 연구를 허용하지 않는 비 침습적 인 세포 기반 분석.
광 바이오 센서를 생산하도록 설계센서 표면에 결합되는 광의 특성에 측정 가능한 변화. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 공진 파장 격자 (RWG) 기법을 포함 소멸 파를 이용하는 광 바이오 센서는, 주로, 센서 표면에 고정 생물학적 수용체에 결합하는 분자의 친화도 및 반응 속도를 검출하기 위해 사용되어왔다. 최근 시판 RWG 바이오 센서는 높은 공간 해상도 (최대 3.75 μM / 픽셀) 5에서 센서 표면에 부착 한 세포의 바닥 부 내의 질량 상대적인 변화의 검출을 허용하도록 개발되었다. 이러한 바이오 센서는 세포 부착 및 퍼짐, 독성, 증식 및 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에) 포함하여 세포 표면 수용체의 다양한 의해 유도 신호 전달 경로와 같은 자극으로부터 발생 살아있는 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지 할 수있는 6 . RWG 바이오 센서는 상대적으로 찬 검출바이오 센서 (7)의 150 nm의 사이에서 질량 상대적인 변화의 함수로서 굴절률의 GE. 세포를 바이오 센서에 도금되는 경우, 굴절률의 변화는 바이오 센서에 부착 세포의 변화로 인한 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 반영. 이 프로토콜은 RWG 바이오 센서를 사용하여 채널의 단백질 상호 작용의 검출에 대해 설명합니다.
RWG 데이터 수집 시스템의 몇 가지 요소로 구성됩니다. X-BODY 생명 과학 BIND 스캐너가이 실험에 사용 되었기 때문에, 우리는 플레이트 리더, 관련 바이오 센서, BIND 스캔 수집 소프트웨어, BIND보기 분석 소프트웨어 8로 구성이 특정 시스템의 구성 요소를 참조해야한다. 광자 결정 바이오 센서는, 광학 바이오 센서를 이하에서 언급 할의주기적인 배열로 구성되어 특정의 빛의 전파를 방지한다 2 또는 3 차원의 유전체 재료파장 및 방향. 광자 결정 구조는 나무의 변종이라는 현상을 기반으로합니다. 처음으로 1902 년에 발견 목재, 이러한 변이는 특히 회절 차수의 세기의 급격한 변동이 소정의 좁은 주파수 대역에서 발생하는 광 회절 격자에 의해 반사되는 빛의 스펙트럼에서 관찰 된 효과이다. 1962 년 Hessel의 및 Oliner 유한 기간의 격자가 서 공명 파장 9를 생성하는 나무의 이상 현상의 새로운 이론을 제시했다. 여기에 설명 된 광 바이오 센서에서 나무의 이상이 흰색 빛으로 자극하는 경우가 파장 만 매우 좁은 밴드 (대표적으로는 850-855 nm의) 반영 RWG 바이오 센서를 생산하는 데 사용됩니다.
개별 바이오 센서는 높은 굴절률 유전체 이산화 티탄 (티오이)의 얇은 층으로 코팅되어 주기적 표면 구조를 가진 저 굴절률 플라스틱 재료로 구성되어있다. 때 biosens또는 광자 결정의 광 격자가 BIND 스캐너에서 분광 광도계로 측정되는 빛의 파장의 좁은 범위를 반영하는 광범위한 파장의 광원으로 조명된다. 반사 된 파장 (피크 파장 값 또는 PWV)의 피크 강도는 그 신호로부터 계산된다. 바이오 센서 표면의 근접성 내의 질량의 증가 또는 감소 (~ 150 nm 정도)의 결과로서 굴절율의 변화에 따라 빛 시프트 PWV. 광 바이오 센서는 생명 과학을위한 표준 협회 (SBS) 이러한 실험에 사용 된 분석을위한 384 – 웰 마이크로 플레이트에 통합됩니다.
RWV 바이오 센서는 셀 10 생활에 외인성 신호의 추가에 변화를 감지하는 데 사용됩니다. 세포를 직접 RWG 바이오 센서의 표면 상에 배양하고 굴절 로컬 인덱스의 변화는 특정 자극 치료시 모니터링된다. 바이오 센서의 질량의 변화의 방향이 될 수있다로컬 바이오 센서 근처의 질량 증가로 굴절 결과의 인덱스의 증가는 PWV의 증가로서 측정되기 때문에, 결정. 반대로 질량 감소는 PWV의 감소를 생성한다. 검출 PWV의 변화는 세포 접착의 변화, 단백질 모집 / 해제, 엔도 시토 시스 및 재활용, 세포 외 유출, 세포 사멸 및 세포 골격의 재 배열 등 다양한 세포 사건에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 분석은 칼륨 채널 및 다른 세포질 또는 세포 골격 성분 간의 채널 단백질 상호 작용의 변화를 검출 할 수있다. 이벤트는, 그러나, 바이오 센서 근처 ~ 150 nm의 검출 영역 내에서 발생하고, 세포막 근처 연결된 셀의 경우한다. 세포 반응의 취득은 BIND 스캔 소프트웨어와 함께 수행되며 SBS 플레이트의 웰 (384)의 각각의 이미지 표현이 생성된다. 이 시스템은 하나의 셀에있는 이벤트의 검출을 허용 최대 3.75 μM / 화소의 해상도를 가지며,(예 : HEK293 또는 CHO 세포와 같은) 세포 라인 이상 생리학 관련 기본 세포로도 사용할 수 있습니다. BIND View 소프트웨어와 이미지 분석은 개별 세포의 인구 모두에서 세포 반응의 검출을 할 수 있습니다. 바이오 센서는 마이크로 플레이트 384 – 웰 표준 SBS에 통합됨에 따라, 시스템은 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 용이하게 적응할 수있다.
공진 파장 격자 광 바이오 센서 (11)는 이전의 GPCR의 활성화 다음 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지하기 위해 사용되어왔다. 우리 연구소는 두 나트륨 활성화 (K NA) 칼륨 채널, 슬랙-B와 슬릭 (12)를 복제했다. 둘 다 B 흔들림 매끄러운 채널의 활성이 매우 강력한 단백질 키나제 C (PKC)의 활성화 (13)의 직접적인 영향을받을 것으로 나타났다. 이러한 M1 무스 카린 수용체와 mGluR1 대사성 글루타메이트 R 등 Gα Q의 단백질 결합 수용체의 활성화eceptor, 유력 PKC 활성화를 통해 채널의 활동을 조절한다. 이러한 K 나 채널은 지속적인 신경 자극 동안 적응 올릴 액션 타이밍의 정확도는 14 전위 조절. 여유 채널 FMRP, 허약 한 X 정신 지체 단백질 (15, 16)를 포함하여 세포질 신호 분자의 다양한 상호 작용하는 것으로 알려져있다. 유년기 (MMPSI), 심한 발달 지연 (17) 결과 간질의 조기 발병 형태의 다수의 마이그레이션 부분 발작의 여유 결과 돌연변이.
Protocol
Representative Results
Discussion
Z 프라임 (Z ') 요소는 높은 처리량 스크리닝 검사 (20)의 품질을 정량화하는 일반적인 통계 방법이며,이 분석에서 GPCR 작용제의 심사 SBS 호환 384 잘 분석에서 발생했기 때문에, 훌륭한을 제공합니다 이 분석 (21)의 안정성과 유효성의 측정. 1 애리조나 '값이 존재하지 않는 표준 편차와 데이터 포인트의 무한한 번호를 이론적으로 최적의 분석을 나타냅니다. 0.5 이하의 소폭 정보…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 안정적으로 쥐 한산한-B 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 관대 한 기부에 대한 예일 대학에서 박사 프레드 Sigworth의 실험실에서 박사 양양 얀에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한 저자는 비디오 소개에 표시 여유의 극저온 전자 현미경 상 동성 모델의 박사 Sigworth에게 감사의 말씀을 전합니다.이 연구는 LKK에 NIH 보조금 DH067517 및 NS073943에 의해 지원되었다
Materials
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. a. O., A, A. A New Theory of Wood’s Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
