Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben
Summary
Die Isolierung von Krebsstammzellen (KSZ), die direkt aus menschlichen Geweben ist Voraussetzung für ihre biologische Charakterisierung. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Isolierung von Prostata-Krebsstammzellen aus menschlichen Geweben, aber auch mit Tipps zur Fehlerbehebung schwierige Schritte.
Abstract
Die Krebsstammzellen (CSC)-Modell wurde erheblich in den letzten zwei Jahrzehnten revisited. Während dieser Zeit KSZ wurden identifiziert und direkt isoliert aus menschlichen Geweben und seriell in immundefizienten Mäusen propagiert, typischerweise durch Antikörpermarkierung von Subpopulationen von Zellen und Fraktionierung mittels Durchflusszytometrie. Allerdings haben die einzigartigen klinischen Eigenschaften von Prostatakrebs erheblich begrenzt das Studium der Prostata KSZ von frischen menschlichen Tumorproben. Wir berichteten kürzlich über die Isolierung der Prostata-Krebsstammzellen direkt aus menschlichen Geweben durch ihre HLA-Klasse-I (hlai)-negative Phänotyp. Prostatakrebszellen aus chirurgischen Proben entnommen und mechanisch dissoziiert. Eine Zellsuspension erzeugt und mit Fluoreszenz-konjugierte hlai und Stromazellen Antikörpern markiert. Subpopulationen von hlai-negativen Zellen werden schließlich mit einem Durchflusszytometer isoliert. Die wichtigste Einschränkung dieses Protokoll ist das häufig mikroskopischen und multifokale Naturprimären Krebs in Prostatektomie Proben. Dennoch sind isolierter lebender Prostata-Krebsstammzellen für die molekulare Charakterisierung und funktionellen Validierung durch Transplantation bei immungeschwächten Mäusen.
Introduction
Intratumorale Heterogenität wird als ein Kennzeichen von Krebs 1 sein. Tatsächlich mehrere Mechanismen der intratumoralen Heterogenität beschrieben wurden, einschließlich genetischer Mutation und Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung. Darüber hinaus können einige Krebsarten eine zelluläre Hierarchie mit einer Subpopulation von Krebsstammzellen (KSZ), die die Eigenschaften tumorinitiierende Kapazität und Selbsterneuerung in serielle Transplantation Assays 2-5 zeigt enthalten. Zunächst in hämatologischen 6, Brust 7 und 8 Malignitäten des Gehirns beschrieben, wurden auch in KSZ Prostatakrebs 9-12 sowie andere Tumortypen 2-5 untersucht.
CSCs werden im Allgemeinen als ein Zellfraktion innerhalb einer heterogenen Bevölkerung 5.2. Daher ist die funktionelle und molekulare Charakterisierung von CSC ist abhängig von ihrer Anreicherung von Großgruppen. Dementsprechend wird während der letzten zwei Jahrzehnte mehreren erfüllthodologies von CSC Bereicherung entwickelt worden, welche typischerweise die Trennung von markierten Populationen mittels Durchflusszytometrie. Darüber hinaus ist eine wichtige Überlegung bei der Untersuchung von CSC dass die hierarchische Organisation von menschlichen Geweben können durch experimentelle Manipulationen wie serielle Passagen in Kultur oder immundefizienten Mäusen gestört werden. Als Ergebnis wurde die direkte Isolierung des CSC aus menschlichen Geweben als wichtige Methodik im Bereich CSC entstanden.
Prostatakrebs ist eine der häufigsten Ursachen von Krebs Morbidität und Mortalität in den Vereinigten Staaten und der ganzen Welt 13. Daher ist von erheblichem Interesse die Isolierung und biologische Charakterisierung von Prostata-Krebsstammzellen. Prostata-CSCs zuvor aus Zelllinien, Patienten abgeleitet Xenografts und niedrige Durchgang Patienten abgeleitet Suspensionskulturen 9,10,12,14 bereichert.
Wir berichteten kürzlich über die Isolierung der Prostata-Krebsstammzellen unmittelbar aus der Menschen chirurgischen sBeispiele aufgrund ihrer hlai-negative Zelloberflächen-Phänotyp 10. Hier werden wir ausführlich die für die Isolierung dieser Zellen implementierten Verfahren. Prostatatumoren aus chirurgischen Proben entnommen und in Zellsuspensionen hergestellt. Die Zellen werden dann unter Verwendung von Antikörpern gegen hlai sowie Stromazellen und Lebensfähigkeit Marker gefärbt und CSC werden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert. Isoliert CSCs können dann für Tests lebensfähigen Zellen erfordern verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von CSC aus frischen menschlichen Prostata-Krebsgewebe. Einige wichtige Überlegungen beeinflussen das erfolgreiche Ergebnis dieses Protokolls.
Die Erholung der hohen Zahl von lebensfähigen Prostatakrebs-Zellen ist abhängig von der sorgfältigen Beurteilung der Brutto chirurgischen Proben. Nach unserer Erfahrung ist die erfolgreiche Isolierung von tumorerzeugenden Zellen der Prostata am besten gewährleistet, wenn makroskopische Tumorknoten werden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Familie Hariri-Stiftung und der TJ Martell Foundation unterstützt.
Materials
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning cell gro | 21-031-CM | |
| 60 mm-15 mm cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conial tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tune | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | ebioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
References
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