コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール
Summary
人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。
Abstract
二次元ゲル電気泳動（2DE）は潜在的に異なる生理学的または病理学的状態に関連するプロテオームの変更を明らかに強力なツールです。基本的に、この技術は、第一工程におけるそれらの等電点に係るタンパク質の分離に基づいており、そして第二SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によってそれらの分子量に記載の方法。本報告書では、ヒトの死後、マウス脳組織の少量のための最適化されたサンプル調製プロトコルが記述されている。この方法は、両方の二次元蛍光差ゲル電気泳動（2D-DIGE）とミニ2DEイムノブロッティングを行うことが可能となる。これらのアプローチの組み合わせは、一質量分析検出との相溶性にそれらの発現のおかげで、新しいタンパク質および/またはタンパク質修飾を見つけることができるだけでなく、またマーカーの検証への新しい洞察。このように、ミニ2DEポストを特定し、検証するために、ウェスタンブロッティングを許可に結合された翻訳の修正、蛋白異化と異なる条件および/または処理間の定性的な比較を提供します。ここで、我々は、ADなど、アミロイドβペプチドとα-シヌクレインなどのレビー小体型認知症に見られるタンパク質凝集体の成分を研究するための方法を提供する。我々の方法は、このようプロテオームの解析のために適合させることができ、不溶性タンパク質もヒト脳組織およびマウスモデルから抽出する。並行して、それは、神経変性疾患、ならびに潜在的な新規バイオマーカーおよび治療標的に関与する分子および細胞経路の研究に有用な情報を提供することができる。
Introduction
精神的、神経学的障害は、病気の世界的な負担の13パーセントを表し、病態生理学的メカニズム、リスク要因と前駆症状のバイオマーカーのような新たな課題は、1を模索しなければならない。この目的に沿ったもので、人間の脳のプロテオミクス研究は、生理学的のためだけでなく、病理学的状態のためだけでなく、メモリ、行動、感情やインスタンスの神経可塑性のようなプロセスに関与する分子経路を明らかにすることが不可欠になる。従って、動物モデルの使用、より具体的にはトランスジェニックマウスは、ヒト神経変性障害の病因2を模倣する可能性の広い範囲をもたらす。
プロテオミクスアプローチは神経科学分野では、これらの新しい視点を達成するために、現在では利用可能です。二次元ゲル電気泳動（2DE）は、広範囲の試料のプロテオームを比較することができ、強力かつ簡単な方法である可能性が高い。また、も識別し、さらに質量分析によって分析するために複雑な混合物からタンパク質を単離するための強力な方法。 （IEF）を等電点電気泳動による等電点（pI）に係る1）タンパク質分離：この技術は、本質的に2つの連続するステップからなる。より正確には、電位がpH勾配の中でイモビアクリルアミドストリップに印加され、次いでタンパク質は、それらのグローバルネット電荷の関数に移動し、決定されたpIに焦点を当てる。 2）等電集束タンパク質が変性しており、それによって負にその第1の構造体中のタンパク質をSDS-PAGE 3によってそれらの見かけの分子量（MW）に応じて分離され、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の添加によってチャージされる。これら二つの異なる性質は、私たちはプロテオームの研究では、さらに行くためにdouble値に対処することができます。一方で、このアプローチは、最小限の染料2D-DIGE法を用いて定量分析を実行するために可能性を提供し、一方qualitativウェスタンブロッティングに結合されたミニ2DEによるE分析。
2D-DIGEによる定量分析は、タンパク質の発現は、すべてのサンプルプロテオーム的に変化授ける。簡潔には、サンプルは三つの異なる波長（青、緑、赤）で発光する3シアニン（Cy 2を表し、Cy3およびCy5）で標識される。 N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を含有するこれらのフッ素最小限の染料は、共有結合、アミド結合4で得られたタンパク質のリジン残基のε-アミノ基と反応する。リジン残基は、タンパク質および主要なネットチャージ修正5,6ごとに複数のラベルの追加を防ぐ唯一の1〜3％、したがって、ラベルが付いています。 Cy3およびCy5は、多くの場合、Cy2は、比較したサンプルの同じ割合の組み合わせをタグしながら、2の独立したサンプルを標識するために使用される。 2つの主な利点は、全ての標識されたサンプルが混合され、IEFおよびSDS-PAGEの比較をゲル化するため、実験間のばらつきを回避する間、ステップごとに一度に1つのゲル中で行われていることである。また、タンパク質7の約1フェムトモルの高い検出閾値を示す。ゲルを走査し、2次元ソフトウェアがCy2と質量分析によるそれらの後方同定のためのスポットのうち統計的差異の同定を可能にする内部標準としての2Dゲルの蛍光画像を比較している。内部標準を用いて二次元解析ソフトウェアは、統計的信頼8の95％以上を有するサンプル間の差の10％未満の迅速な検出を達成する。
ミニ2DEによる定性分析は、タンパク質の特性評価のための重要なステップである。原理は、以前のpI及びMW分離のために記載したのと同じであるが、この場合、タンパク質は、膜およびイムノブロッティングに小さなポリアクリルアミドゲルから転送され、その後実行される。一次元ゲル電気泳動は、抗体の機能における1つまたはいくつかのタンパク質のエピトープのためのタンパク質発現の変化、情報技術を提供するがミニ2DEのNは、2つの追加パラメータを指定して賦与。まず、タンパク質isovariantsは、翻訳後修飾が起こる可能性があることを示す、pIはの関数として変化する。第二に、質量分析同定は、もっともらしいチモーゲン及びタンパク質の異化生成物を示すことができる。従って、2D-DIGEによって観察修飾は、グローバルプロテオームプロフィールの変化のメカニズムを示す可能性がある。同じタンパク質のエピトープのためのいくつかのサンプル間のイムノブロットのアライメント/ミニ2DEによるSはやや一次元免疫ブロッティング9、10で観測されたりしない翻訳後の変化に光を流して酸味の変更を反映することができる。さらに、この分析は、代謝残基11,12のPIとMWの知識に起因する潜在的な切断部位について通知します。
これら2つの技術の組み合わせは、相補的なプロテオミクス分析を提供する。一方では、2D-DIGEは、標準をもたらす表情は異なりますポリペプチドの正確な分離を可能差異のE。これらの違いは、スポットや蛍光ゲルのソフトウェア解析によって指定された1の強度の増加/減少の表示または非表示に本質的になる。しかし、それ自体でこれらの観察は、観察修飾の性質を説明する可能性は低い。の等変/アイソフォームレベルの変化：ポリペプチドを単離し、質量分析により同定されると、これらの理由から、ミニ2DEの使用は）正確に1を確認するために、単離されたタンパク質のアイデンティティと差の2）自然を可能にします例えば、発現、翻訳後修飾および切断プロセス。しかし、それは非常に似ていない抽出プロトコールの使用から生じる潜在的な分散体を制限するために2D-DIGEと、ミニ2DEと互換性両方の出発溶解緩衝液を開発する必要がある。
本稿では、デヒトおよびマウスの組織から来る脳タンパク質の2D-DIGEとミニ2DE技術の準備、抽出、性能に適合したプロトコルをスクライビング。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質の病理学的な発現変化を発見、バイオマーカー探索および薬理学的標的の可能性経路の調節がneuroproteomicsの目的の一つであるが30に近づく 。新興のツールの中で、2DEフィールドが有望予想されているものが追加されます。それにもかかわらず、コンセンサスがばらつきを最小限にし、実験で再現性を高めるために、到達されるべきである。このアイデアの行に2D-DIG…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、向かわせる、リール2大学、MEDIALZ、LabEx（卓越した研究室、プログラムは将来のための投資）とDISTALZ（アルツハイマー病への横断型アプローチのための革新的な戦略の開発）によってサポートされていました。 FJ.FGは現在、ANR（フランス国立研究機関/ NeuroSpliceドタウ01プロジェットANR-2010-BLAN-1114）の受信者の交わりですが、この作品はJCCM（スペイン）からの助成金の支援の下にもありました。
Materials
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval/size | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Reference in function of the pH interval desired | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Plastic box to make the passive rehydration |
| MILLEX GS Filter | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | Reference in function of the MW to separate | |
| IPGphor III Isoelectric Focusing Unit | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Large Electrophoresis System | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
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