Protéines consensus dérivé du cerveau, Protocole d'extraction pour l'étude de l'homme et du protéome murin cerveau en utilisant deux 2D-DIGE et Mini 2DE Immunoblotting

Summary

Un protocole d'extraction de la protéine en utilisant un tampon commun urée / thiourée / SDS pour le tissu cérébral des souris humain et permet indentification de protéines par 2D-DIGE et leur caractérisation ultérieure par un mini 2DE immunoblot. Cette méthode permet un pour obtenir des résultats plus fiables et reproductibles à partir de biopsies humaines et des modèles expérimentaux.

Abstract

Deux dimensions électrophorèse sur gel (2DE) est un outil puissant pour découvrir les modifications du protéome potentiellement liés aux différentes conditions physiologiques ou pathologiques. Fondamentalement, cette technique est basée sur la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique dans une première étape, et d'autre part en fonction de leur poids moléculaire par SDS sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). Dans ce rapport, un échantillon protocole de préparation optimisé pour petite quantité de tissus post-mortem et le cerveau de la souris humaine est décrite. Cette méthode permet d'effectuer à la fois un gel électrophorèse bidimensionnelle de différence de fluorescence (2D-DIGE) et d'un mini 2DE immunoblot. La combinaison de ces approches permet de trouver non seulement de nouvelles protéines et / ou des modifications des protéines dans leur expression grâce à sa compatibilité avec détection par spectrométrie de masse, mais aussi un nouvel éclairage sur la validation des marqueurs. Ainsi, mini-2DE couplé à un permis de transfert de Western pour identifier et valider poste-Traductionnelles des protéines, des modifications du catabolisme et fournit une comparaison qualitative entre les différentes conditions et / ou traitements. Ici, nous fournissons une méthode pour étudier les composants d'agrégats de protéines trouvées dans la MA et la démence à corps de Lewy, comme le peptide bêta-amyloïde et l'alpha-synucléine. Notre méthode peut donc être adaptée pour l'analyse du protéome et d'extraire les protéines insolubles à partir des modèles de tissu cérébral des souris et humaines aussi. En parallèle, il peut fournir des informations utiles pour l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les maladies neurodégénératives ainsi que des biomarqueurs de nouveaux potentiels et les cibles thérapeutiques.

Introduction

Les troubles mentaux et neurologiques représentent 13% de la charge mondiale de morbidité, de nouveaux défis tels que les mécanismes physiopathologiques, les facteurs de risque et des biomarqueurs avant-coureurs doivent être explorées ^1. Conformément à cet objectif, la protéomique études du cerveau humain deviennent indispensables pour découvrir voies moléculaires impliquées dans des processus tels que la mémoire, le comportement, les émotions et la plasticité neuronale, par exemple, non seulement pour des raisons physiologiques, mais aussi pour des conditions pathologiques. Par conséquent, l'utilisation de modèles animaux et plus particulièrement les souris transgéniques, apporte un large éventail de possibilités d'imiter l'étiologie des troubles neurodégénératifs humains ^2.

Approches protéomiques sont aujourd'hui disponibles pour accomplir ces nouvelles perspectives dans le domaine des neurosciences. Une électrophorèse sur gel bidimensionnelle (2DE) est une méthode simple et efficace qui permet susceptibles de comparer le protéome d'une vaste gamme d'échantillons. En outre, il est égalementméthode puissante pour isoler une protéine d'un mélange complexe dans le but d'identifier et d'analyser plus en détail par la spectrométrie de masse. Cette technique consiste essentiellement en deux étapes successives: 1) séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique (pI) par isoélectrofocalisation (IEF). Plus précisément, un potentiel électrique est appliquée entre les bandes d'acrylamide de immobiline entre un gradient de pH et protéines vont migrer et de se concentrer sur un pi déterminé en fonction de leur charge nette globale. 2) les protéines sont dénaturées porté isoélectrique et chargées négativement par l'addition de dodécylsulfate de sodium (SDS), ainsi les protéines dans leur première structure sont séparés en fonction de leur poids moléculaire apparent (PM) par SDS-PAGE ^3. Ces deux propriétés distinctes permettent de nous attaquer à une valeur double à aller plus loin dans l'étude du protéome. D'une part, cette approche offre la possibilité d'effectuer une analyse quantitative utilisant des colorants minimales méthode 2D-DIGE, et d'autre part un qualitativanalyse de e par mini-2DE couplé à un transfert de Western.

L'analyse quantitative par 2D-DIGE donne l'expression des protéines change tout sur l'échantillon protéome. Brièvement, les échantillons sont étiquetés avec trois cyanines (Cy2, Cy3 et Cy5) émettant à trois longueurs d'onde distinctes (bleu, vert et rouge). Ces colorants minimes fluor contenant un groupe ester de N-hydroxy succinimidyle réagissent avec le groupe de résidus lysines des protéines entraînant des liaisons amide covalentes ⁴ ε-amino. résidus de lysine sont marqués seulement entre 1-3% et empêchant ainsi plusieurs étiquettes plus par des protéines et des modifications importantes de charge nette ^{5, 6.} Cy3 et Cy5 sont souvent utilisés pour marquer deux échantillons indépendants tout en Cy2 Tags un mélange de proportion égale des échantillons à comparer. Les deux principaux avantages sont que tous les échantillons étiquetés sont mélangés et IEF et SDS-PAGE sont effectuées dans un gel à la fois pour chaque étape, en évitant l'inter variabilité des expériences dues à des gels comparaison. De plus, il présente un seuil de détection élevé de l'ordre de 1 femtomole de protéine ^7. Les gels sont numérisés et logiciel 2D comparent les images de fluorescence sur gel 2D, où Cy2 sert d'étalon interne pour permettre l'identification de différences statistiques entre les spots pour leur identification postérieure par spectrométrie de masse. Le logiciel d'analyse 2D en utilisant l'étalon interne permet d'obtenir une détection rapide de moins de 10% des différences entre les échantillons avec plus de 95% de confiance statistique ^8.

L'analyse qualitative par mini-2DE est une étape cruciale pour la caractérisation des protéines. Le principe est le même que celui décrit précédemment pour la séparation et le pI MW, mais dans ce cas, les protéines sont transférées à partir d'un gel de polyacrylamide à petite membrane et une immuno-empreinte est réalisée par la suite. Bien que l'on électrophorèse sur gel de dimension fournit des changements dans l'expression de la protéine pour un ou plusieurs épitopes de protéines en fonction de l'anticorps, l'information de mini-2DE apporte deux paramètres supplémentaires. Tout d'abord, les isovariants de protéines changent en fonction de la pi, ce qui indique que des modifications post-traductionnelles pourraient avoir lieu. En second lieu, l'identification par spectrométrie de masse peut être une indication de zymogènes plausibles et des produits cataboliques de protéines. Par conséquent, les modifications observées par 2D-DIGE sont susceptibles indicative des mécanismes sous-jacents des changements dans le profil global du protéome. Les alignements de immunoblots entre plusieurs échantillons pour le même épitope de protéine / s par mini-2DE peuvent refléter des changements d'acidité qui éclairent en variations post-traductionnelles peu observés ou même pas par immuno monodimensionnel ^{9, 10.} En outre, cette analyse renseigne sur les sites de clivage potentiels dus à la connaissance de la pI MW et des résidus métaboliques ^11,12.

La combinaison de ces deux techniques permet une analyse protéomique complémentaire. D'une part 2D-DIGE offre un type de différences permettant un isolement précis de polypeptides dont l'expression est différente. Ces différences sont essentiellement constitués par l'apparition ou la disparition d'un endroit ou d'augmentation / diminution de l'intensité d'un être déterminé par l'analyse logicielle des gels fluorescents. Cependant, ces observations se sont peu susceptibles d'expliquer la nature de la modification observée. Pour ces raisons, une fois que le polypeptide est isolé et identifié par spectrométrie de masse, l'utilisation de mini-2DE permet de confirmer avec précision 1) l'identité de la protéine isolée, et 2) la nature de la différence: changement dans le niveau de isovariant / isoforme expression, modifications post-traductionnelles et les processus de clivage par exemple. Cependant, il est nécessaire de développer un tampon de lyse à partir à la fois compatible avec 2D-DIGE et avec mini-2DE afin de limiter les dispersions éventuelles résultant de l'utilisation de protocoles d'extraction qui sont très dissemblables.

Dans le présent article, on dedécrit un protocole adapté à la préparation, l'extraction et la performance des techniques mini-2DE pour les protéines du cerveau provenant de tissu humain et de souris 2D-DIGE et.

Protocol

1. Homogénéisation et extraction de protéines totales de l'homme et de la souris tissu cérébral Cerveau homogénéisation des tissus. Homogénéiser le tissu cérébral de 10% (p / v) dans 8 M d'urée, 2 M thiourée et 1% p / v de tampon SDS (UTS) à l'aide d'un verre de potier (pour les échantillons humains) ou Téflon homogénéisateur (pour les échantillons de souris). Traitement par ultrasons à 60 30 Hz des impulsions avec un générateur d'ultrasons pour l'application de 0…

Representative Results

Protéomique sur le tissu cérébral reste difficile car aucun tampon idéal existe pour récupérer 100% de protéines, en particulier associée à la membrane ou des protéines du cytosquelette. La première série d'expériences a été axée sur la recherche d'un tampon de lyse approprié compatible avec les deux approches et qui permet de récupérer un large panel de protéines. Ainsi, trois tampons de lyse ont été analysés afin de déterminer la plus appropriée. Tout d'abord, on a utilisé le tamp…

Discussion

Découvrir les changements d'expression de protéines pathologiques, recherche de biomarqueurs et la modulation des voies possibles pour cibles pharmacologiques sont parmi les objectifs des neuroprotéomique approches ^30. Au milieu des nouveaux outils, le domaine 2DE ajoute une expectative prometteur. Néanmoins, un consensus devrait être atteint afin de minimiser la variabilité et augmenter la reproductibilité dans les expériences. Conformément à cette idée un protocole normalisé pour effectuer 2…

Materials

CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Plastic box to make the passive rehydration
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	Gel Company	P2D1.5