קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר
Summary
הפרוטוקול מתאר את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים.
Abstract
Assay micropocket קרנית העכבר הוא assay חזק וכמותיים in vivo להערכת אנגיוגנזה. על ידי שימוש בכדורים בשחרור איטי סטנדרטיים המכילים גורמי גדילה ספציפיים שמעוררים צמיחת כלי דם בכל הקרנית באופן טבעי avascular, אנגיוגנזה ניתן למדוד ולכמת. ב assay זה התגובה angiogenic נוצרה במהלך כמה ימים, תלוי בסוג והמינון של גורם גדילה בשימוש. האינדוקציה של neovascularization מופעלת בדרך כלל על ידי או גורם בסיסי גידול פיברובלסטים (bFGF) או גורם כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF). על ידי שילוב של הגורמים הללו צמיחה עם סוקרלפט וHydron (פולי המו (פולי (methacrylate 2-Hydroxyethyl))) וליהוק התערובת לתוך כדורים, הם יכולים להיות מושתלים בניתוח בעין העכבר. כדורים אחידים אלה לאט-לשחרר גורמי גדילה על פני חמישה או שישה ימים (bFGF או VEGF בהתאמה) המאפשרים תגובת angiogenic מספיקה הנדרשת לq אזור הספינהuantification באמצעות מנורת סדק. assay זה יכול לשמש ליישומים שונים, כוללים ההערכה של תרופות angiogenic מאפנן או טיפולים, כמו גם השוואה בין רקע גנטי שונה המשפיע על היווצרות כלי דם. חוקר מיומן לאחר תרגול assay זה יכול להשתיל גלולה בפחות מ -5 דקות לכל עין.
Introduction
התהליך של אנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים בצורה קודמת נותרים אלה, הוא מורכב מאוד והוא מוסדר על ידי מספר גורמים במשק ששולטים בצעדים שונים של הנבטה הכלי והמורפוגנזה. אנגיוגנזה מופעלת עקב שינוי באיזון בין גורמים בעד ונגד אנגיוגנזה, איזון, כי בדרך כלל שומר על כלי הדם במצב שקט. אנגיוגנזה במבוגרים מתרחשת בתנאים מסוימים פיסיולוגיים כמו במהלך מחזור השחלות הנקבה או בתהליכי תיקון כגון ריפוי פצעים והתחדשות רקמות. עם זאת, זה גם סימן היכר של כמה פתולוגיות הכוללים גידולים ממאירים, מחלות אוטואימוניות ומחלות דלקתיות. המעורבות של אנגיוגנזה בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים אלה הופכת אותו לנושא חשוב למחקר וליעד אטרקטיבי לטיפול.
בשל המורכבות של אנגיוגנזה ומעורבותם של כמה ceLLS וגורמים בתהליך, כוללים תאים אנדותל, pericytes, תאים במחזור ותאי סטרומה, במודלים חוץ גופית יישארו מוגבלים ולא יכולים לשחזר את microenvironment הייחודי in vivo. העיקרי במבחני חוץ גופית של אנגיוגנזה מתמקדים במידה רבה בהתבוננות השפעות ישירות על תאי האנדותל ומדידת צעדים מסוימים בתהליך angiogenic בתנאים מבוקרים. מבחני אלה כוללים את הכימות של תא האנדותל התפשטות 1, הגירה 2, היווצרות רשת 3, היווצרות צינור 4 ומבצבצות spheroids 5. דגמי Ex vivo, שלא כמו במבחנה אלה, הם מורכבים יותר ולשלב סוגים שונים של תאי רקמה, דוגמא ש assay טבעת אב העורקים 6. עם זאת, כמו מערכות אחרות, זה לא יכול ללכוד את תרומתם של תאים במחזור וסטרומה הטבעית של תאי האנדותל כקיים בגוף חי. ניסיונותללמוד אנגיוגנזה תחת זרימה לחקות את הגדרת in vivo מבוצעים באמצעות מערכות microfluidic 7, אפילו אולם מבחני אלה, למרות שהשתפר מאוד, עדיין לא מצליחין להסביר את כל התאים קיימים בגוף חי.
בשל המגבלות של במבחנה ולשעבר מודלים אנגיוגנזה vivo, in vivo מודלים יישארו הבחירות אמינות יותר ללימודי אנגיוגנזה. דוגמאות למודלים אלה כוללים השתלה של תאים שקופים, "חלונות", המאפשרים ההדמיה של כלי דם גדלו תחת מיקרוסקופ 8, CAM שתלים תת עורית בהזרקה כגון היווצרות matrigel וכלי ברקמות נורמליות כמו אוזן עכבר וקרום chorioallantoic העוף ( ). עם זאת, אחד מדגמי אנגיוגנזה in vivo המקובלים וכמותיים ביותר הוא assay קרנית neovascularization micropocket המתואר כאן, המנצל את באופן טבעי avascularקרנית כ" מסך "כדי לחזות ולהעריך צמיחת angiogenic חדשה 9.
כאן אנו מתארים את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים. בתחילה המודל המשמש למדידת גירויי angiogenic ספציפיים בקרניות ארנב. הדבר נעשה על ידי החדרת חתיכות גידול לתוך ההומור המימית של הלשכה הקדמית של העין הארנב ונמדד neovascularization מושרה גידול 11.
עם זאת, assay מאוחר יותר התפתח לחוקר את ההשפעות של גידול ספציפי גורמי 10 לציין טוב יותר ולתקנן את השפעת angiogenic. על מנת לשחרר את גורם הגדילה בעיניים, כדורים בשחרור איטי המכילים כמויות ידועות של גורמי גדילת angiogenic שמשו במקום רקמות. הזמינות של חלבוני angiogenic רקומביננטי מטוהרים כגון bFGF או VEGF אפשרה את השימוש בם כמטרות ספציפיות של modulaters אנגיוגנזה 12. בתחילה, assay היהמשמש בעיקר בארנבות, שהם קלים יותר לעבוד עם בשל גודלם, אך מאוחר יותר המודל תורגם לעכברים; מודל חיה קטן יותר ופחות יקר. עובר מארנב לעכברים סיפק יתרון חשוב של להיות מסוגל להשתמש בבעלי חיים מניפולציות גנטיים, ובכך ליצור תחום חדש של מחקר למרכיבים הגנטיים המשפיעים על היווצרות כלי דם 13. בנוסף לשימוש מקובל יותר של assay קרנית בלימוד אנגיוגנזה, תהליכים ביולוגיים אחרים יכולים גם נחקר באמצעות מבחני שונה. לדוגמא, מחקרים של lymphangiogenesis התאפשרו באמצעות ההשתלה של כדורים במינון bFGF נמוכים שאפשרו להדמיה של כלי הלימפה דרך סמנים מולקולריים ספציפיים 14. בנוסף, assay זה סיפק אמצעי כדי להעריך את ההשפעות של קרינה על אנגיוגנזה 15.
לסיכום, assay אנגיוגנזה micropocket הקרנית הוא כמותי, נציגroducible, הערכה גמישה של אנגיוגנזה in vivo. יתרון עיקרי של assay זה הוא שהמדידה של כלי רקע היא מיותרת, משום שהכולים גדלים על רקמות באופן טבעי avascular. אנו מתארים כאן את הפרוטוקול של assay זה בפרטים ולדון בתרחישים שונים שיכול להתרחש. Assay כולל 3 מקטעים בדידים. כאן אנו מתארים את ההכנה של כדורי גורם כלול צמיחה, השתלה כירורגית שלאחר מכן ולבסוף שיטה לכמת את צמיחת neovascular וכתוצאה מכך.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר צעדים קריטיים בביצוע assay קרנית מוצלח. הוא עושה הראשון כדורים אחידים אפשר להשתיל ומגרים כלי. החלקים החשובים ביותר של הכנת גלולה הם 1) שימוש בגורם גדילה ללא ספק; 2) להבטיח תערובת טובה של גורם גדילה עם סוקרלפט וHydron ו3) נע התערובת הסופית במהירות אבל בזהירות מצינור E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקריסטין ג'ונסון לעבודה הגרפית.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
- Glaser, B. M., D’Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells. Nature. 288, 483-484 (1980).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).
- Montesano, R., Orci, L. Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell. 42, 469-477 (1985).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).
- Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies. In Vitro. 18, 538-549 (1982).
- Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).
- Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D’Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).
- Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).
- Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D’Amato, R. J. Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice. FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).
- Chang, L. K., et al. Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).
- Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D’Amato, R. J. Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution. Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).
- Turner, P. V., Albassam, M. A. Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia. Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).
