細胞外マトリックスは、創傷治癒、炎症や腫瘍形成の間に、実質的なリモデリングを受ける。我々は、線維性のダイナミクスならびにエピ蛍光または二光子顕微鏡を用いて、高い空間分解能と時間分解能を有する網目状のマトリックス成分を可視化する新規な生体免疫蛍光顕微鏡法を提示する。
組織形態を維持するための物理的な足場であることに加え、細胞外マトリックス(ECM)は、活発に開発および臓器の恒常性中に細胞および組織の機能の調節に関与している。それは、生物活性ECMタンパク質断片の放出を介してなど、生体力学的、生化学的、生物物理学的およびシグナル伝達経路を介して作用する組織の緊張を調節し、細胞移動のための経路を提供することによってこれを行う。腫瘍微小環境の細胞外マトリックスは、線維性および非線維状マトリックスタンパク質の分解、堆積および組織によって特徴付けられる、実質的なリモデリングを受ける。腫瘍微小環境の間質補強は、腫瘍の増殖および浸潤を促進し、血液やリンパ管のリモデリングを引き起こす可能性があります。マトリックスタンパク質のライブイメージングは、しかし、この点にマトリックス成分リットルの大部分を残して、多光子顕微鏡を用いて第二高調波発生によって検出することができる線維性コラーゲンに制限されるargely見えない。ここでは、薄い背側の耳の皮膚細胞外マトリックスタンパク質の免疫標識とエピ蛍光と2光子顕微鏡を用いて、生きたマウスでの露出した組織の生体内イメージングにおける腫瘍接種のための手順について説明します。我々の生体内イメージング法は、成長する皮膚腫瘍の文脈における線維性および非線維状基質タンパク質の両方の直接検出を可能にする。我々は、ローカルマトリックス収縮による血管リモデリングの例を示す。また、第二高調波発生を用いて検出、腫瘍の線維性マトリックスは、我々はまた、腫瘍細胞と腫瘍細胞とT細胞の相互作用の長期(12時間)画像を示し、例えば、テネイシンCとして新たに堆積され、マトリックス成分から空間的に別個であることがわかっ基底膜のコラーゲンIVに沿って移行。まとめると、この方法は、一意的にPROVもよく、経時的に腫瘍細胞の同時検出、それらの物理的微小環境および内因性組織の免疫応答を可能にする腫瘍の進行および最終的な成功または治療に対する耐性のメカニズムにIDEの重要な洞察。
炎症性、転移性およびマトリックスリモデリング過程の生体内イメージングは、研究の重要な分野であると蛍光タンパク質1,2を表現数々のトランスジェニックレポーターマウスモデルの作成 を動機としている。による画質を低下させ、組織を通して光透過を制限する焦点外の蛍光シグナルに、撮像厚い組織は、共焦点又は多光子走査顕微鏡3で可能である。より速く、より安価で複雑 なエピ蛍光顕微鏡を用いてのみ、例えばニワトリ漿尿膜4又はマウス耳真皮5とほぼ二次元の組織で可能である。ほとんどの画像化システムは、細胞型特異的様式で様々な蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを利用する。これらのタンパク質は、弱い毒性を提供するにもかかわらず、それらが免疫応答を誘導する6。さらに、特定の細胞サブタイプの間で切り替えたり、マークすることが困難であるこのような変化のようなIRの基礎または活性化状態は、新しい遺伝モデルの準備が必要です。蛍光タンパク質の発現は、一般的に細胞内区画に制限されるように加えて、それは通常、基底膜タンパク質又は組織ケモカイン堆積物7のような画像外の構造には不可能である。その代わりに、細胞外の抗原に対する抗体を用いた間接標識は、事実上すべての細胞型もしくはマトリックス特定のコンポーネント8,9のための柔軟性を提供します。しかし、この標識アプローチの主な欠点は、補体系依存性細胞毒性および細胞と細胞外構造10の食作用を引き起こすことができ、抗原-抗体免疫複合体によって仲介される免疫毒性と関連している。
炎症または創傷治癒の間の腫瘍微小環境のではなく、正常組織の細胞外マトリックスは、実質的なリモデリングを受ける。腫瘍微小環境の間質補強はPROMOでき応力によって誘発されるシグナル伝達機構と、血液やリンパ管11の原因のリモデリングにTE腫瘍の増殖および浸潤。しかしながら、マトリックスタンパク質のライブイメージングは、多光子顕微鏡を用いて第二高調波発生によって検出することができる線維性コラーゲンに限定される。最近では、光と画像化された細胞や組織構造5への免疫毒性の損傷のリスクを最小限に抑える新たな生体内イメージング法を公開しています。連続的な生体内の可視化の単一ラウンド2時間12-17に30分の範囲である確立されたイメージング技術と比較して、我々の生体内免疫蛍光(IF)の技術は、12時間(長期8)イメージングせた。なお、撮像時間は、我々の動物プロトコルで定義された制限に起因し、12時間に限らず、それが延長することができないという技術的な反指示がされていないことに注意することが重要であるかの血圧及び心拍等動物の重大な健康パラメータ速度は、08を制御する。また、自動化された蛍光実体顕微鏡を使用することにより、我々は、単一の実験中に複数のフィールドから画像を収集することができましたし、機能的な血液やリンパ管でサポートされている皮膚の生理学的な文脈で発生したまれな免疫学的および再構築のプロセスを観察した。実体顕微鏡レンズは、比較的大きな2 cmの作動距離を有する2光子顕微鏡の光学系とは対照的に浸水を気化させる必要がないため、長期の撮像のみ蛍光実体顕微鏡下で行った。生体IFは、正常な皮膚の任意の細胞外マトリックス成分の免疫標識および検出を可能にした。この技術の設計は、有害な免疫毒性の5を発生させることなく、生細胞および外科的に露出させ、マウスの真皮上の組織化行列要素の免疫染色を使用した革新的なコンセプトに基づいています。外科的手技自体は真皮に安全である脈管構造とは独立に神経支配されている耳、自律的に血液によって供給され、別々のリンパ循環により排出における2つのスキン層の分離にのみ依存している。私たちの実験は可能に血液やリンパ管および創傷治癒プロセス間の白血球の輸送を含む、少なくとも12時間かけて重要な病態生理学的なイベントの範囲の画像化。初版発行では、生体内イメージングの様々な分野における最先端の規格に当社の技術を比較した。したがって、我々は、初期のリンパ管15を回収する代わりに、予想入る免疫細胞のユニークな視覚化を含む様々なタイプの白血球によって血管外遊出およびリンパ脈管内事象を観察した。また、他のグループ9,18によって行わ観察を補完し、我々は、in vivoにおける CCL21の収集にまれにしか初期のリンパ管に強い不連続堆積物を形成することができることを見出した。
<p19であり、例えばテネイシンCのようなマトリックス分子を含む動的な腫瘍微小環境のコンテキストで撮像癌細胞浸潤のために使用することができることを示している。我々は、腫瘍の繊維状マトリックスは、二次高調波発生で検出し、さらに、我々は、ローカルマトリックス収縮による血管リモデリングの例を記載長期テネイシンC.からなる新たに堆積され、マトリックスよりも腫瘍微小環境の異なる位置を占めることがわかっ用語(12時間)腫瘍細胞および基底膜のコラーゲンIVに沿った腫瘍細胞の移動とT細胞の相互作用のイメージング。同時に、このような血管のPEなどの局所生理学的パラメータを記録しながら、そのようなイベントは、画像化され得るrmeabilityやリンパ排液。意義
ここでは、高解像度と線維性だけでなく、網目状のマトリックスタンパク質を含む様々な組織の微小環境構成要素の動的な可視化を可能にする新たな生体顕微鏡のアプローチを提示します。 (i)の生体内蛍光イメージングは、血液から又はリンパ管への溶質の漏れを追跡するために、 例えば 、微小循環の研究において使用されてきたが、免疫染色と組み合わされていない:このメソッドは、現在の生体内イメージング技術を上回るいくつかの利点を有する。 (ii)の遺伝的に修飾されたレポーターマウスの使用は、画像化される特定の細胞タイプを可能にするが、それらの可用性(または新しいものを作成するために相当な努力)を必要とし、研究することができる細胞型相互作用の数を制限する。 (iii)の細胞外マトリックスは、第二高調波発生を用いてインビボで画像化することができるが、この技術は、唯一の重要な細胞外成分を大量に残して、繊維状コラーゲンを検出することができる基底膜、フィブロネクチン、テネイシン、成長因子、ケモカインおよび現在の研究のための手の届かない組織グリコサミノグリカンのような。我々の方法は、これらの制限を克服し、標準的なイメージング技術は、成長因子( 例えば VEGF 26)およびケモカイン(CCL21 5,18及び図2Dに結合する他の細胞型、組織構造、ヘパリン硫酸の沈着のための免疫染色を配合し、さらに組み合わせることを可能にする)、または細胞外マトリックスタンパク質を同時に血液および/またはリンパの流れを追跡しながら。
制限事項
生体内のIFの落射蛍光イメージングは、厚い皮下組織(脂肪組織)を奪わ薄い皮フラップ、に制限されています。我々は、背側の耳の耳真皮は皮膚の比較的無害外科用展示に最適である、技術IF生体内で落射耳真皮に限定されず、 例えば、潜在的に適用できることがわかっている間つま先や新生児マウスの背中の皮膚の露出した皮膚。免疫蛍光の急速な抗体染色(15分)受動拡散に依存していないが、リンパ管が27を閉塞している場合、したがって染色が観察されないことができ、機能性リンパ排液と間質液の流れを必要とする場合。それと並んで、リンパ管は強いし、漏れやすい血管系(負傷した血管、細動脈)5を染色。背側と腹側の耳の皮膚フラップの分離は、軽度の手術ですが、それは様々な組織の細胞にいくつかの毛細血管や細胞死への損傷を引き起こす。 1は、 例えば 、細胞の生存に対する薬物の穏やかな効果を見て、完全に無傷の組織を調査する必要がある場合に問題になる可能性があります。また、光毒性および光退色から皮膚を保護する働きをする抗酸化剤の適用は、組織の酸化的ストレスまたは酸化窒素BIOLOG 例えば研究するための生体内免疫蛍光技術の使用を排除するY。
最後に、免疫複合体と組織常在性マクロファージの盲検化は、これらの細胞及び組織の免疫応答及び樹状細胞の活性化の研究などの影響をアクティブにすることができます。
修正とトラブルシューティング
組織の酸化的ストレスまたは酸化窒素の生物学を研究するために、アスコルビン酸は、実験出力を妨害しない他の組織適合性培地と交換しなければならない。研究の目的は、組織免疫応答および樹状細胞の活性化および遊走の機能および活性化である場合には同様に、皮膚免疫細胞上のFc受容体をブロックすることは避けるべきである。これは、Fcフラグメントに開裂(のF(ab)2抗体断片)を有する二次抗体の使用または検出試薬としてビオチン化抗体及び蛍光ストレプトアビジンを用いて行うことができる。
将来の応用
当社は、新規でユニークな内を提示二光子顕微鏡を用いて検出されたSHG-原線維および成熟コラーゲンとの組み合わせにおける移植皮膚腫瘍における細胞外マトリックスの画像非フィブリル成分に対する技術IF不可欠。落射蛍光画像上に多光子(または共焦点)顕微鏡法を使用する利点の1つは、z-スタッキング可能性があり、中結果、細胞外マトリックス内で発生するイベントの共局在空間、リンパ管又は血管内へ、例えば腫瘍脈管内する場合の標準的な落射蛍光顕微鏡法は、侵入細胞の形態学的変化から推測することができる。この技術は、はるかに広い可能性を秘めている。例えば、我々は、リンパ特異的光力学的治療27によってリンパ管閉塞のメカニズムを調べるために生体内IFを使用している。この方法のさらなる潜在的な用途としては、炎症の間、皮膚免疫の研究、移植拒絶又は血液及びリンパの方法の機構に限定されるものではない腫瘍形成時のATIC血管増殖。
手順の重要なステップ
生理的な組織環境を維持するための重要な意味を持っている最も重要なステップは、背側真皮から腹側皮膚や軟骨の外科的分離である。切断または主要動脈または静脈を閉塞することは治療法や細胞運動8に対する細胞応答に影響を与えるであろう、過度の出血や地元組織低酸素につながる。外科接着剤で耳が公開する組織に接着剤をこぼしなどの注意を払って行う必要があり、固定化することは、血管の閉塞によって組織に永久的な損傷の原因となります。マウスの温度を37℃に調節し、維持しなければならない眼および肺が正常に実験中に加湿とどまるように加えて、加湿された酸素は、イソフルラン麻酔のために使用される必要がある。また、アスコルビン酸ナトリウムを新たに準備する必要があり、そのpHは、使用前にチェック。
要約するとntent ">、この生体内免疫蛍光は、マウスの皮膚における複雑な細胞の事象の分子イメージングと生理機能の実時間、地元の測定をブリッジします。それは簡単にポスト発達などの研究に適用することができるさらに、この方法は、大きな可能性を秘めている血液及びリンパ脈管形成の機構または種々の病原体により皮膚感染の初期段階を可視化する。その柔軟性と高スループット電位では、この生体内技術は著しく生物学の複数のフィールドに寄与することができる。The authors have nothing to disclose.
著者らは、画像処理における助けジェレミーのCMテオとS.ライアンオリバーの貢献のためとヨランタKilarskaに感謝しています。私たちは、2光子顕微鏡をサポートするためにローザンヌ連邦工科大学でのBIOPの中核施設に感謝
この作品は、欧州研究委員会(DC-リンパ、206653から2)、欧州フレームワーク·プロジェクト7(AngioScaff)、スイス国立科学財団(31から135756)、および米国国立衛生研究所からの助成金によって部分的にサポートされていました(NIH)/ NIH心肺血液研究所(NHLBI)(RO1 HL096539)。また、ロバート·ウェナー賞(スイス癌連盟)からの資金は、購入本研究で使用したライカの実体顕微鏡ができました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |