המטריצה תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני פוטונים במיקרוסקופ.
מלבד היותו פיגום פיזי כדי לשמור על מורפולוגיה רקמות, המטריצה תאית (ECM) מעורבת באופן פעיל בויסות תפקוד תא ורקמות במהלך התפתחות והומאוסטזיס איברים. היא עושה זאת על ידי מתנהג דרך מסלולי איתות ביוכימי, ביומכנית, וbiophysical, כגון באמצעות שחרורו של שברי חלבון ECM ביו, המסדיר את המתח ברקמות, ומספקים מסלולים לנדידת תאים. המטריצה תאית של microenvironment הגידול עוברת שיפוץ משמעותי, המתאפיין בשפלה, בתצהיר וארגון של חלבוני מטריצה סיבי ולא סיבי. התקשות סטרומה של הגידול microenvironment יכולה לקדם את צמיחת גידול ופלישה, ולגרום לשיפוץ של כלי דם והלימפה. ההדמיה חיה של חלבוני מטריצה, עם זאת, לנקודה זו מוגבלת לcollagens סיבי שיכול להיות מזוהה על ידי דור השני הרמוני באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון, ומשאירה את רוב רכיבי מטריצת largely בלתי נראה. כאן אנו מתארים נהלים לחיסון גידול בעור אוזן הגב הדק, immunolabeling של חלבוני מטריצת חוץ תאיים והדמיה intravital של הרקמה נחשפה בעכברים חיים באמצעות epifluorescence ושני פוטונים במיקרוסקופ. שיטת ההדמיה intravital שלנו מאפשרת זיהוי הישיר של שני סיבי וחלבונים מטריצה שאינה סיבי בהקשר של גידול עורי הולך וגדל. אנחנו מראים דוגמאות לשיפוץ כלי שיט הנגרמים על ידי התכווצות מטריצה מקומית. מצאנו גם כי מטריצה סיבי של הגידול זוהה עם הדור ההרמוני השני היא מובחנת מרחבית מרכיבי מטריצה שהופקדו זה עתה כגון ג tenascin אנחנו גם הראו הדמיה לטווח ארוך (12 שעות) של אינטראקציה תא T עם תאים סרטניים ותאים סרטניים הגירה לאורך קולגן IV של קרום במרתף. יחדיו, שיטה זו מאפשרת באופן ייחודי לזיהוי בו זמני של תאים סרטניים, microenvironment הפיזי שלהם ואת התגובה החיסונית רקמות אנדוגני לאורך זמן, מה שעשוי provתובנות חשובות IDE למנגנונים שבבסיס התקדמות גידול והצלחה או עמידות לטיפול אולטימטיבית.
ההדמיה intravital של תהליכי שיפוץ דלקתי, גרורתי ומטריקס כבר שטח חשוב של מחקר והניעה את היצירה של מודלים רבים מהונדסים כתב עכבר שמבטאים חלבוני ניאון 1,2. בשל אותות ניאון מחוץ לפוקוס, אשר להפחית את איכות תמונה ואת גבולות חדירת האור דרך הרקמה, רקמה עבה הדמיה אפשרית רק עם confocal או סריקה רב פוטון מיקרוסקופית 3. השימוש מהיר יותר, מיקרוסקופיה epifluorescence פחות יקרה והמורכבת היא אפשרית רק עם רקמות כמעט דו ממדים כגון קרום עוף Chorio-allantoic 4 או הדרמיס אוזן עכבר 5. רוב מערכות ההדמיה לנצל את עכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון שונים באופן ספציפי לסוג תא. למרות שהחלבונים אלה מציעים phototoxicity החלש, הם לגרום תגובה חיסונית 6. יתר על כן, קשה לעבור בין תת תא הספציפי או לסמןבסיס ir או מדינות הופעלו כשינוי כזה דורש הכנת מודל גנטי חדש. בנוסף, כביטוי חלבון פלואורסצנטי בדרך כלל מוגבל לתא תאיים, זה בדרך כלל לא ניתן למבנים תאיים תמונה כמו חלבוני קרום במרתף או בפיקדונות chemokine רקמת 7. במקום זאת, תיוג עקיף עם נוגדנים כנגד אנטיגנים תאיים מציע גמישות עבור כמעט כל מרכיב תאים מסוג מסוים או מטריצה 8,9. עם זאת, החסרון העיקרי של גישת תיוג זה קשור לimmunotoxicity בתיווכו של מתחמים חיסוניים אנטיגן נוגדן שיכול לגרום לרעילות השלמה מערכת תלויה תא וphagocytosis של תאים ומבנים תאיים 10.
המטריצה תאית של microenvironment הגידול, אלא גם של רקמה נורמלית במהלך דלקת או ריפוי פצע, עוברת שיפוץ משמעותי. התקשות סטרומה של microenvironment הגידול יכולה פרומוצמיחת te גידול ופלישה בשל מנגנוני איתות שנגרם עקב מתח ושיפוץ סיבה של דם וכלי הלימפה 11. עם זאת, הדמיה חיה של חלבוני מטריצה מוגבלת לcollagens סיבי שיכול להיות מזוהה על ידי דור השני הרמוני באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון. לאחרונה יש לנו שפורסם בשיטת הדמיה intravital רומן שימזער את הסיכון לפגיעה בצילום וחיסוני רעילה לתאים צילמו ומבני רקמה 5. בהשוואה לשיטות הדמיה שהוקמו בו בסיבוב של ההדמיה intravital רציפה אחת הוא בטווח של 30 דקות עד 2 שעות 12-17, immunofluorescence intravital הטכניקה (IF) אפשר 12 שעות (לטווח ארוך 8) הדמיה. חשוב לציין כי בפעם ההדמיה מוגבלת ל12 שעות בשל מגבלות שנקבעו בפרוטוקול של בעלי החיים שלנו, אבל אין נגד סימנים טכניים שלא יכול להיות ממושך זה אם פרמטרים קריטיים לבריאותו של בעל החיים, כמו לחץ דם ולבהשיעור נשלטים על 8. בנוסף, על ידי השימוש בסטראו הקרינה אוטומטית היינו יכול לאסוף תמונות מתחומים רבים במהלך ניסוי אחד ונצפיתי תהליכים חיסוניים ושיפוץ נדירים שהתרחשו בהקשר הפיזיולוגי של העור נתמך על ידי דם תפקודי וכלי הלימפה. בגלל עדשת stereomicroscopic יש 2 סנטימטר, מרחק גדול יחסית, עבודה וזאת בניגוד לאופטיקה המיקרוסקופית שני הפוטונים אינו דורשת אידוי טבילה במים, הדמיה לטווח ארוך בוצעה רק בסטראו הקרינה. Intravital אם מותר התיוג וזיהוי חיסוניים של כל רכיב מטריצה תאי של העור הרגיל. העיצוב של טכניקה זו מבוסס על הקונספט החדשני של שימוש immunostaining לתאי חיים ואלמנטי מטריצת רקמת הדרמיס על עכבר שנחשף בניתוח מבלי לגרום להשפעות מזיקות immunotoxic 5. ההליך הכירורגי עצמו הוא בטוח לדרמיס כלי דם כפי שהוא מסתמך רק על ההפרדה בין שתי שכבות עור באוזן, כי הם באופן עצמאי מעוצבבים, האכיל באופן אוטונומי על ידי דם ורוקן על ידי תפוצה הלימפה נפרדת. ההתקנה הניסיונית שלנו מאפשרת הדמיה של מגוון רחב של אירועי פתיו פיסיולוגיות חשובים על פני 12 שעות לפחות, ובכלל זה סחר בויקוציטים בין כלי דם והלימפה ותהליכי ריפוי פצע. בפרסום המקורי, בהשוואה הטכניקה שלנו לתקני מדינה-of-the-art בתחומים שונים של ההדמיה intravital. כתוצאה מכך, אנו נצפו extravasation כלי דם ואירועי intravasation הלימפה על ידי סוגים שונים של לויקוציטים, כולל ההדמיה הייחודית של תאים חיסוניים נכנסים איסוף במקום צפוי כלי הלימפה ראשוני 15. כמו כן, המשלימים את התצפיות שנעשו על ידי קבוצות אחרות 9,18, מצאנו כי בCCL21 vivo הוא מסוגל ליצור פיקדונות חזקים, רציפים על איסוף אבל רק לעתים רחוקות על lymphatics הראשונית.
<p c= "Jove_content" ילדה> כאן אנו מתארים intravital שונה אם טכניקה שיכולה להיות משולב עם שני פוטונים במיקרוסקופ כדי לזהות רשת של collagens סיבי באמצעות דור הרמוני שני (SHG). אנו מראים כי שיטה זו יכולה לשמש גם לפלישת תאי סרטן ההדמיה בהקשר של microenvironment הגידול הדינמי, הכולל מולקולות מטריצה כגון C tenascin, כי הם נחקרו במידה רבה על ידי טכניקות הדמיה הנוכחיות 19. מצאנו כי המטריצה סיבי של הגידול, מזוהה עם הדור השני ההרמוני, תופסת מיקומים שונים של הגידול microenvironment יותר המטריצה שהופקדה זה עתה מורכב מtenascin C. יתר על כן, אנו מתארים דוגמאות לשיפוץ כלי שיט הנגרמים על ידי התכווצות מטריצה מקומית, ארוכים הדמיה טווח (12 שעות) של אינטראקציות תא T עם תאים סרטניים ונדידת תאים סרטניים יחד קולגן IV של הקרום במרתף. יכולים להיות צילמו אירועים כאלה בזמן ההקלטה בו זמנית פרמטרים פיסיולוגיים מקומיים כגון PE כלי דםrmeability וניקוז לימפטי.משמעות
כאן אנו מציגים גישת מיקרוסקופיה intravital רומן המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ודינמית של רכיבי המיקרו רקמות שונים, כוללים סיבי כמו גם חלבוני מטריקס כמו רשת. לשיטה זו מספר יתרונות על פני שיטות הדמיה intravital הנוכחיות: (i) דימות פלואורסצנטי Intravital נעשתה שימוש במחקרים בזרימת דם, למשל, לעקוב אחר דליפה מומסת מהדם או לlymphatics, אבל לא כבר בשילוב עם immunostaining. (Ii) השימוש בעכברים מהונדסים גנטי כתב מאפשר לסוגי תאים מסוימים להיות צילמו, אבל דורש הזמינות שלהם (או מאמץ משמעותי כדי ליצור חדש) ומגביל את מספר האינטראקציה סוגי תאים שניתן ללמוד. (Iii) מטריצה תאית ניתן הדמיה in vivo באמצעות דור שני הרמוני, אך טכניקה זו יכולה רק לזהות collagens הסיבי, והשאירה מספר רב של מרכיבים תאיים חשוביםכגון קרומי מרתף, fibronectins, tenascins, גורמי גדילה, כמוקינים וglycosaminoglycans רקמות מחוץ להישג יד למחקר הנוכחי. השיטה שלנו מתגברת על מגבלות אלה, ומאפשרת טכניקות הדמיה סטנדרטיות להיות משולבות ועוד יותר בשילוב עם immunostainings לסוגי תאים אחרים, מבני רקמות, פיקדונות של סולפט הפרין מחייבים גורמי גדילה (למשל VEGF 26) וכמוקינים (CCL21 5,18 ואיור. 2D ), או חלבוני מטריצת חוץ תאיים תוך מעקב דם ו / או תזרים הלימפה בו זמנית.
מגבלות
ההדמיה epifluorescence של IF intravital מוגבלת לדשי עור דקים, נשללו בהיפודרמיס העבה (רקמת שומן). למרות שאנו מצאנו כי הדרמיס אוזן הגבי הוא אופטימלי לחשיפה כירורגית מזיקה יחסית של עור האוזן, epifluorescence עם intravital אם טכניקה אינה מוגבלת לדרמיס אוזן ועלול להיות מיושם לדוגמההעור החשוף של אצבעות הרגליים או העור האחורי של עכבר שזה עתה נולד. צביעה מהירה נוגדן (15 דקות) בimmunofluorescence אם אינה תלויה בדיפוזיה פסיבית אך דורשת ניקוז לימפטי פונקציונלי וזרימת נוזל ביניים, ולכן אין כתמים ניתן להבחין אם כלי הלימפה הוא occluded 27. בקנה אחד עם זה, כלי הלימפה כתם דם בכלי דם דולף ואז חזק יותר (כלי נפצעו, arterioles) 5. ההפרדה הגבי ודשי עור אוזן הגחון היא הליך כירורגי קל אבל זה גורם לפגיעה בכמה נימים ומוות של תאים לתאי רקמות שונים. זו עלולה להיות בעיה כאשר אחד צריכה לחקור רקמות שלמות לחלוטין, למשל מסתכל על ההשפעה המתונה של תרופות על הישרדות תא. גם היישום של חומר נוגד חמצון, המשמש להגנה על העור מפני phototoxicity וphotobleaching אינו כולל את השימוש בטכניקת immunofluorescence intravital ללמוד למשל סטרס חמצוני רקמה או Biolog תחמוצת חנקןy.
לבסוף, מסנוור של מקרופאגים תושב רקמות עם מתחמים חיסוניים יכול להפעיל את התאים וההשפעה למשל המחקר של תגובה חיסונית רקמות והפעלת תאים דנדריטים אלה.
שינויים ופתרון בעיות
על מנת ללמוד סטרס חמצוני רקמה או ביולוגיה תחמוצת חנקן, ascorbate יש להחליף עם תקשורת רקמות אחרת תואמת שאינו מפריעה לתפוקה הניסיונית. כמו כן, יש להימנע מקולטני Fc חסימה על תאים חיסוניים עורי אם המטרה של המחקר היא הפונקציה וההפעלה של התגובה החיסונית הרקמות והפעלת תאים דנדריטים והגירה. ניתן לעשות זאת עם השימוש בנוגדנים משני עם בר Fc ביקע (F (ab) 2 שברי נוגדנים) או השימוש בנוגדן biotinylated וstreptavidin ניאון כמו ריאגנטים זיהוי.
יישומים עתידיים
אנו מציגים פנים חדשים וייחודייםחיוני אם טכניקה לרכיבים שאינם סיבי דימוי של מטריצה תאית בגידולי עור להשתלה בשילוב עם סיבי זוהה-SHG וcollagens התבגר באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. אחד היתרונות של שימוש רב פוטון (או confocal) מיקרוסקופית על פני ההדמיה epifluorescence הוא אפשרות לערום-z ותוצאה המרחבית שיתוף לוקליזציה של אירועים המתרחשים בתוך מטריצה תאית, למשל intravasation גידול לתוך הלימפה או כלי דם, אשר במקרה של מיקרוסקופיה epifluorescence סטנדרטית ניתן להסיק רק משינויים מורפולוגיים של התאים הפולשים. טכניקה זו יש פוטנציאל הרבה יותר רחב. לדוגמא, יש לנו להשתמש intravital IF כדי לחקור את המנגנון של חסימת הלימפה על ידי טיפול פוטודינמי הלימפה ספציפית 27. יישומים אפשריים נוספים של שיטה זו כוללים, אך אינם מוגבלים לחקירה של חסינות עור בזמן דלקת, מנגנון של דחיית שתל או בשיטות של דם והלימפה צמיחת כלי ATIC במהלך tumorigenesis.
שלבים קריטיים בהליך
הצעד החשוב ביותר שיש לו השלכות קריטיות לקיום סביבת רקמה פיזיולוגית הוא הפרדה כירורגית של עור הגחון וסחוס מהדרמיס הגבי. חיתוך או הגורם לחסימת העורק או וריד הגדול תוביל לדימום יתר וחוסר חמצן ברקמות מקומי, אשר ישפיע על תגובה תאית לטיפולים ותא תנועה 8. משתקות האוזן עם דבק כירורגים צריכים להיעשות בזהירות כשפיכת הדבק על לחשוף רקמה יגרום לפגיעה בלתי הפיכה לרקמה על ידי חסימה של כלי דם. הטמפרטורה של העכבר חייבת להיות מבוקרת ושמרה על 37 ° C. בנוסף, חמצן humidified צריך לשמש להרדמת isoflurane, כך שהעיניים וריאות להישאר humidified כראוי במהלך הניסוי. כמו כן, נתרן ascorbate חייב להיות מוכן טרי וה-pH שלה בדקה לפני השימוש.
ntent "> לסיכום, immunofluorescence intravital זה מגשר בזמן אמת, מדידות מקומיות של פונקציה פיזיולוגית עם הדמיה מולקולרית של אירועים תאיים מורכבים בעור העכבר. יתר על כן, בשיטה זו יש פוטנציאל גדול כפי שהוא יכול להיות מיושם בקלות לדוגמה: מחקר שלאחר התפתחותיים מנגנונים של דם והלימפה אנגיוגנזה או לדמיין את השלבים המוקדמים של זיהום בעור על ידי סוכני פתוגניים שונים. בזכות הגמישות שלה ואת פוטנציאל תפוקה גבוהה, טכניקת intravital זה יכול לתרום באופן משמעותי לתחומים רבים של ביולוגיה.The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לג'רמי CM Teo וס ראיין אוליבר, על תרומתם ויולנטה Kilarska לעזרה בעיבוד תמונה. אנו מודים למתקן הגרעין בביופסיה של EPFL על תמיכתם במיקרוסקופ שני פוטונים
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מהנציבות האירופיות למחקר (DC-ימפה, 206,653-2), מסגרת האירופית פרויקט 7 (AngioScaff), הקרן השוויצרית הלאומית למדע (31-135,756) וקרן מכוני בריאות הלאומית של ארה"ב (NIH) NIH לב /, ריאות ודם מכון (NHLBI) (RO1 HL096539). בנוסף, כספים ומונר פרס רוברט (שוויצרית סרטן הליגה) אפשרו הרכישה סטראו לייקה בשימוש במחקר זה. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |