Die extrazelluläre Matrix unterliegt erheblichen Umbau während der Wundheilung, Entzündung und Tumorgenese. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz Intravital-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die Dynamik der Fibrillen sowie netzartige Matrix-Komponenten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Epi-Fluoreszenz-oder Zwei-Photonen-Mikroskopie visualisieren.
Abgesehen davon, dass eine physikalische Gerüst Gewebemorphologie beizubehalten, wird die extrazelluläre Matrix (ECM) aktiv bei der Regulierung der Zell-und Gewebefunktion während der Entwicklung und Homöostase beteiligt Organ. Es tut dies, indem über biochemische, biomechanische und biophysikalische Signalwege, wie zum Beispiel durch die Freisetzung von bioaktiven ECM-Protein-Fragmente handelt, die Regulierung Gewebespannung und die Bereitstellung Wege für die Zellmigration. Die extrazelluläre Matrix der Tumor-Mikroumgebung erfährt erhebliche Umgestaltung, gekennzeichnet durch den Abbau, Ablagerung und Organisation von fibrillärem und nicht-fibrillärem Matrixproteine. Stromal Versteifung der Tumor-Mikroumgebung kann das Tumorwachstum und Invasion zu fördern und dazu führen, Umbau des Blut-und Lymphgefäße. Live-Darstellung von Matrixproteine, zu diesem Punkt ist jedoch begrenzt auf fibrillären Kollagene, die mit Multi-Photonen-Mikroskopie durch Erzeugung der zweiten Harmonischen nachgewiesen werden können, so dass die Mehrheit der Matrixkomponenten largely unsichtbar. Hier beschreiben wir Verfahren zur Tumorimpfung in der dünnen Rückenohrhaut, Immunmarkierung von extrazellulären Matrixproteinen und intravitalen Bildgebung des exponierten Gewebes in lebenden Mäusen mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie. Unsere intravitalen Abbildungsverfahren ermöglicht die direkte Detektion von sowohl fibrillärem und nicht-fibrillärem Matrixproteinen im Zusammenhang mit einer zunehmenden Hauttumor. Wir zeigen Beispiele von Schiff Umbau von lokalen Matrix Kontraktion verursacht. Wir fanden auch, dass fibrilläre Matrix der mit der Erzeugung der zweiten Harmonischen detektiert Tumor ist räumlich getrennt von neu abgeschiedenen Matrixkomponenten wie Tenascin C Wir zeigten auch langfristig (12 Stunden) Abbildung von T-Zell-Interaktion mit Tumorzellen und Tumorzellen Migration entlang der Kollagen IV der Basalmembran. Zusammen genommen, erlaubt dieses Verfahren einzigartig für den gleichzeitigen Nachweis von Tumorzellen, deren physische Mikro und der endogenen Gewebeimmunantwort über die Zeit, die prov kannide wichtige Einblicke in die Mechanismen der Tumorprogression und möglichen Erfolg oder Therapieresistenz zugrunde liegen.
Intravital-Bildgebung von entzündlichen, metastatischen und Matrix-Umbauprozesse ist ein wichtiger Bereich der Forschung und hat die Schaffung von zahlreichen transgenen Mausmodellen Reporter, die fluoreszierende Proteine exprimieren 1,2 motiviert. Aufgrund out-of-focus Fluoreszenzsignale, die Bildqualität zu verringern und Grenzen Lichteinfall durch das Gewebe, ist Bild dicke Gewebe nur mit konfokaler oder Multi-Photonen-Scanning-Mikroskopie 3 möglich. Verwendung schneller, weniger kostspielig und komplex Epifluoreszenzmikroskopie nur mit nahezu zweidimensionalen Geweben wie Huhn Chorioallantoismembran 4 oder Mäuseohr Dermis 5 möglich. Die meisten Bildgebungssysteme nutzen transgenen Mäusen, die verschiedene fluoreszierende Proteine in einer Zelltyp-spezifische Weise. Auch wenn diese Proteine bieten schwachen Phototoxizität induzieren sie Immunantwort 6. Ferner ist es schwierig, zwischen spezifischen Zelltypen zu wechseln oder zu markieren dieir basale oder aktivierten Zustände als solche Änderung erfordert die Herstellung einer neuen genetischen Modells. Zusätzlich, wie fluoreszierende Proteinexpression wird allgemein intrazellulären Kompartiment beschränkt, ist es meist nicht möglich, die Bildextrazelluläre Strukturen wie Basalmembran-Proteinen oder Gewebeeinlagen 7 Chemokin. Stattdessen indirekte Markierung mit Antikörpern gegen die extrazelluläre Antigene bietet Flexibilität für nahezu jeden Zelltyp-spezifische Komponente oder Matrix 8,9. Jedoch ist der Hauptnachteil dieser Markierungsmethode mit Immun durch Antigen-Antikörper-Immunkomplexe, Komplement-System-abhängige Zelltoxizität und Phagozytose von Zellen und extrazellulären Strukturen 10 auslösen kann vermittelten verbunden.
Die extrazelluläre Matrix der Tumor-Mikroumgebung, sondern auch von normalem Gewebe während einer Entzündung oder Wundheilung, erfährt erhebliche Umgestaltung. Stromal Versteifung der Tumor-Mikroumgebung kann promote Tumorwachstum und Invasion durch Stress-induzierten Signalmechanismen und die Ursache Umbau des Blut-und Lymphgefäße 11. Allerdings ist die Live-Darstellung von Matrixproteinen zu fibrillären Kollagene, die mit Multi-Photonen-Mikroskopie durch Erzeugung der zweiten Harmonischen detektiert werden kann begrenzt. Kürzlich wurde ein neues Intravitalbildgebendes Verfahren, das Risiko von Photo-und Immun-toxische Schädigung abzubildenden Zellen und Gewebestrukturen 5 minimiert veröffentlicht. Im Vergleich mit etablierten bildgebenden Verfahren, wo die einzige Runde der kontinuierlichen intravital Visualisierung in einem Bereich von 30 Minuten bis 2 Stunden 12-17, unsere Intravital-Immunfluoreszenz (IF)-Technik erlaubt 12 Stunden (Langzeit-8)-Bildgebung. Es ist wichtig zu beachten, dass die Aufnahmezeit ist auf 12 Stunden wegen Grenzen in unserem Tier Protokoll definiert beschränkt, aber es gibt keine technischen Gegenanzeigen, dass es nicht verlängert werden kann, wenn kritische Gesundheitsparameter des Tieres, wie Blutdruck und HerzRate gesteuert 8. Zusätzlich wird durch Verwendung eines automatisierten Fluoreszenz-Stereomikroskop konnten wir Bilder aus den verschiedenen Bereichen in einem einzigen Experiment sammeln und beobachtet seltene immunologische und Umbauprozesse, die im physiologischen Kontext der durch funktionelle Blut-und Lymphgefäße unterstützt Haut aufgetreten. Da die stereo Linse eine relativ große, 2 cm, Arbeitsabstand im Gegensatz zum Zwei-Photonen-mikroskopische Optik nicht verdampfenden Wasserlagerung erfordern, wurde langfristig Abbildungs nur unter Fluoreszenz-Stereomikroskop durchgeführt. Intravital wenn erlaubt die Immun Markierung und zum Nachweis jeder Komponente der extrazellulären Matrix der normalen Haut. Das Design dieser Technik basiert auf dem innovativen Konzept der Verwendung von Immunfärbung für lebende Zellen und Gewebematrixelemente auf chirurgisch freigelegt Maus Dermis, ohne dass schädliche immunotoxizität 5 basiert. Das chirurgische Verfahren selbst ist sicher an der DermisGefäßsystem, wie es nur auf der Trennung von zwei Hautschichten im Ohr, die unabhängig voneinander innerviert werden, autonom durch Blut zugeführt und durch getrennte Kreisläufe abgeführt lymphatischen beruht. Unser Versuchsaufbau ermöglicht die Abbildung von einer Reihe von wichtigen pathophysiologischen Ereignisse über mindestens 12 Stunden, einschließlich Leukozyten Handel zwischen Blut-und Lymphgefäße und Wundheilungsprozesse. In der ursprünglichen Veröffentlichung, verglichen wir unsere Technik zu State-of-the-art-Standards in verschiedenen Bereichen der Intravital-Bildgebung. Folglich beobachten wir Blutgefäß Extravasation und lymphatischen Intravasation Ereignisse durch verschiedene Arten von Leukozyten, darunter die einzigartige Visualisierung von Immunzellen Eingabe Sammeln statt der erwarteten Anfangs Lymphgefäße 15. Außerdem ergänzen die Beobachtungen von anderen Gruppen 9,18 getan, fanden wir, dass in vivo CCL21 ist in der Lage, um starke, diskontinuierliche Einlagen auf das Sammeln aber nur selten auf initialen Lymphgefäße bilden.
<p class = "jove_content"> Hier beschreiben wir eine modifizierte Intravital-IF-Technik, die mit Zwei-Photonen-Mikroskopie in Kombination mit dem Netzwerk der fibrillären Kollagene mit Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) zu erkennen. Wir zeigen, dass dieses Verfahren auch für die Bildgebung Invasion von Krebszellen im Rahmen der dynamischen Tumor-Mikroumgebung, die Matrixmoleküle wie Tenascin C, die von aktuellen Bildgebungstechniken 19 weitgehend unerforscht sind, umfasst werden. Wir fanden, dass die fibrillären Matrix des Tumors, wobei die zweite Harmonische detektiert, nimmt verschiedene Stellen der Tumormikroumgebung als die neu abgelagerte Matrix aus Tenascin C zusammen Ferner beschreiben wir Beispiele Gefäß Umbau von lokalen Matrixkontraktion verursacht, lang Ausdruck (12 Stunden) Abbildung von T-Zell-Interaktion mit Tumorzellen und Tumorzellmigration auf Kollagen IV der Basalmembran. Solche Ereignisse können abgebildet werden, während gleichzeitig die Aufnahme lokale physiologische Parameter wie Blutgefäß permeability und Lymphdrainage.Bedeutung
Hier präsentieren wir eine neue Intravitalmikroskopie Ansatz, der hohen Auflösung und dynamische Visualisierung von verschiedenen Gewebemikrokomponenten, einschließlich fibrillären sowie netzartige Matrixproteinen ermöglicht. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber aktuellen Intravitalbildgebenden Verfahren: (i) Intravital-Fluoreszenz-Bildgebung hat in der Mikrozirkulation Studien verwendet wurde, um beispielsweise gelösten Austritt aus Blut-oder Lymphgefäße in die Spur, hat aber nicht mit Immunfärbung kombiniert. (Ii) Die Verwendung von gentechnisch veränderten Reporter Mäusen ermöglicht spezifische Zelltypen abgebildet werden soll, erfordert aber ihre Verfügbarkeit (oder erhebliche Anstrengungen, um neue zu schaffen) und begrenzt die Anzahl von interagierenden Zelltypen, die untersucht werden können. (Iii) Die extrazelluläre Matrix kann in vivo unter Verwendung von zweiten Harmonischen dargestellt werden, aber diese Technik kann nur faserige Kollagen zu erfassen, wobei eine große Anzahl von wichtigen extrazellulären Komponentenwie Basalmembranen, Fibronektinen, Tenascine, Wachstumsfaktoren, Chemokine und Gewebe Glykosaminoglykane außerhalb der Reichweite für die aktuelle Forschung. Unser Verfahren überwindet diese Einschränkungen und können Standard-Bildgebungstechniken eingearbeitet und weiter kombiniert mit Immunfärbungen für andere Zelltypen, Gewebestrukturen, Ablagerungen von Heparinsulfat-bindenden Wachstumsfaktoren (z. B. VEGF 26) und Chemokinen (CCL21 und 5,18 zeigt. 2D ) oder extrazellulären Matrixproteinen und gleichzeitig Tracking Blut und / oder lymphatischen fließt.
Begrenztheit
Die Epi-Fluoreszenz-Bildgebung von Intravital IF ist auf die dünnen Hautlappen, der dicke Unterhaut (Fettgewebe) beraubt begrenzt. Während wir festgestellt, dass die dorsalen Ohr Dermis ist optimal für die relativ harmlosen chirurgischen Darstellung der Ohrhaut, Epi-Fluoreszenz mit Intravital IF-Technik ist nicht auf Ohr Dermis beschränkt und könnte möglicherweise zu z. B. angewendet werdendie freigelegte Haut der Zehen oder der Rückenhaut des neugeborenen Maus. Rapid-Antikörper-Färbung (15 Minuten) in der Immunfluoreszenz IF hängt nicht passive Diffusion, sondern erfordert funktionelle Lymphdrainage und interstitielle Strömung, damit keine Färbung beobachtet, wenn Lymphgefäße 27 verschlossen werden. Im Einklang mit dem, Lymphgefäße Fleck stärker als undichte Blutgefäßsystem (verletzt Gefäße, Arteriolen) 5. Die Trennung des dorsalen und ventralen Hautlappen Ohr ist ein mildes chirurgische Verfahren aber eine Schädigung einigen Kapillaren und Zelltod zu verschiedenen Gewebezellen. Dies könnte ein Problem sein, wenn man völlig intaktem Gewebe zu untersuchen, z. B. Blick auf die milde Wirkung von Drogen auf das Überleben der Zellen benötigt. Auch der Einsatz von Antioxidantien, die die Haut vor Phototoxizität und Photobleaching Schutz dient schließt die Verwendung von Intravital-Immunfluoreszenz-Technik, um z. B. das Gewebe oxidativen Stress oder Stickstoffmonoxid-biologisch studiereny.
Schließlich Verblindung der Gewebe Makrophagen mit Immunkomplexe können diese Zellen und Einfluss z. B. die Untersuchung von Gewebeimmunantwort und Aktivierung dendritischer Zellen zu aktivieren.
Änderungen und Fehlersuche
Um Gewebe oxidativen Stress oder Stickstoffmonoxid Biologie Studie hat Ascorbat mit anderen gewebeverträglichen Medien, die nicht mit dem experimentellen Ausgangs stört ersetzt werden. Ebenso sollten Blockierungs Fc-Rezeptoren auf dermalen Immunzellen vermieden werden, wenn das Ziel der Untersuchung ist die Funktion und Aktivierung des Gewebeimmunantwort und dendritischen Zellen-Aktivierung und Migration. Dies kann mit der Verwendung sekundärer Antikörper mit Fc-Fragment gespalten (F (ab) 2-Antikörperfragmente) oder die Verwendung von biotinylierten Antikörpern und Streptavidin als Fluoreszenznachweisreagenzien durchgeführt werden.
Zukünftige Anwendungen
Wir präsentieren eine neue und einzigartige innerVital IF-Technik für Bild in nicht-fibrillären Komponenten der extrazellulären Matrix in transplantierbaren Hauttumoren in Kombination mit SHG-erkannt fibrillären Kollagene und gereift mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Einer der Vorteile der Verwendung von Multi-Photonen-(oder konfokale) Mikroskopie über Epi-Fluoreszenz-Bildgebung ist z-Stapeln Möglichkeit und in der Folge räumliche Co-Lokalisation von Ereignissen innerhalb der extrazellulären Matrix auftreten, z. B. Tumor Intravasation in Lymph-oder Blutgefäße, die im Falle von Standard Epifluoreszenzmikroskopie kann nur von morphologischen Veränderungen der Zelle eindringenden abgeleitet werden. Diese Technik besitzt viel breiteres Potential. Zum Beispiel haben wir die intravital verwendet werden, wenn der Mechanismus der Okklusion von lymphatischen lymphatischen spezifische photodynamischen Therapie 27 zu untersuchen. Weitere mögliche Anwendungen dieser Verfahren beinhalten, sind aber während der Entzündung, Mechanismus der Transplantatabstoßung oder Methoden von Blut und Lymphe nicht auf die Untersuchung von Haut Immunität beschränkt tischen Gefäßwachstum während der Tumorgenese.
Kritische Schritte in dem Verfahren
Der wichtigste Schritt, die kritische Auswirkungen für die Aufrechterhaltung eines physiologischen Gewebeumgebung weist eine chirurgische Trennung der Bauchhaut und Knorpel von dorsal Dermis. Schneiden oder Verschließen der großen Arterie oder Vene wird auf übermäßige Blutungen und lokale Gewebehypoxie führen, die zelluläre Reaktion auf Behandlungen und Zellbewegung 8 beeinflussen. Immobilisierung das Ohr mit chirurgischen Klebstoff sollte mit Vorsicht, da verschüttet den Kleber auf aussetzen Gewebe durchgeführt werden wird eine dauerhafte Schädigung des Gewebes führen durch Verschluss von Blutgefäßen. Die Temperatur der Maus muss kontrolliert und bei 37 ° C gehalten werden, Zusätzlich muss befeuchteten Sauerstoff zu der Isofluran-Narkose verwendet werden, so dass die Augen und Lungen bleiben richtig während des Experiments befeuchtet. Außerdem muss Natriumascorbat frisch hergestellt werden und ihr pH vor der Verwendung überprüft.
ntent "> Zusammenfassend überbrückt diese Immunfluoreszenz-Intravitalechtzeit, lokale Messungen der physiologischen Funktion mit der molekularen Bildgebung komplexer zellulärer Ereignisse in der Mäusehaut. Außerdem hat diese Methode ein großes Potential, da es leicht zu zB post-Entwicklungsstudie angewendet werden Mechanismen der Blut-und Lymph-Angiogenese-oder die frühen Phasen der Infektion der Haut durch verschiedene Krankheitserreger Mit seiner Flexibilität und Hochdurchsatz-Potenzial visualisieren., kann diese Technik Intravital deutlich um mehrere Felder der Biologie beitragen.The authors have nothing to disclose.
Die Autoren sind dankbar, dass Jeremy Teo CM und S. Oliver Ryan für ihren Beitrag und Jolanta Kilarska um Hilfe bei der Bildverarbeitung. Wir danken der BIOP Core Facility an der EPFL für die Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der Europäischen Forschungskommission (DC-Lymph, 206653-2), der europäischen Rahmen Projekt 7 (AngioScaff), der Schweizerische Nationalfonds (31-135756) und der US National Institutes of Health (NIH) / NIH Herz, Lunge und Blut-Institut (NHLBI) (RO1 HL096539). Darüber hinaus Mittel aus dem Robert Wenner-Preis (Krebsliga Schweiz) erlaubt den Kauf der in dieser Studie verwendeten Leica Stereomikroskop. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |