בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial
Summary
שיטות מתוארות להפרדת chromatographic בשכבה דקה (TLC) של תמציות צמחים וbioautography קשר לזהות מטבוליטים אנטי בקטריאליים. השיטות מיושמות להקרנה של תרכובות פנוליות תלתן אדומים עיכוב חיידקים מייצרי אמוניה היפר (HAB) יליד המסס השור.
Abstract
מסך משותף לתרכובות מיקרוביאלית צמח מורכב של הפרדת תמציות צמחים על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC), חושפת את chromatograms להשעיות של חיידקים (למשל פטריות או חיידקים במרק או אגר), ומאפשרים זמן לחיידקים לגדול ב סביבה לחה, באופן חזותי אזורים ללא התפתחותם של חיידקים. היעילות של שיטת הקרנה זו, הידועה בשם bioautography, תלויה הן באיכות של הפרדת chromatographic והטיפול נלקח בתנאי תרבות של חיידקים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים עבור TLC וbioautography מגע עם יישום חדשני לאמין חיידקי תסיסת חומצה. התמצית מופרדת על צלחות TLC סיליקה (מגובות אלומיניום) גמישות, ולהקות הם דמיינו תחת אור אולטרה סגול (UV). אזורים הם לגזור וטופחו על פנים על אגר מחוסן עם מיקרואורגניזם הבדיקה. להקות מעכבות הם דמיינו ידי מכתימים את הצלחת אגרים עם tetrazolium אדום. השיטה מיושמת להפרדה של תלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland) תרכובות פנוליות וההקרנה שלהם לפעילות נגד sticklandii Clostridium, חיידק היפר לייצור אמוניה (HAB) כי הוא יליד המסס השור. שיטות TLC תחולנה על סוגים רבים של תמציות צמחים ומיני חיידקים אחרים (אירוביים או אנאירובי), כמו גם פטריות, ניתן להשתמש בם כיצורי מבחן אם תנאי התרבות שונו כדי שיתאימו לדרישות הצמיחה של המינים.
Introduction
מנסה לאמוד עבור תרכובות מיקרוביאלית בצמחים דורש הפרדת המרכיבים של תמצית צמח, חושף מיקרואורגניזם בדיקה לרכיבים אלה, וקביעה אם הצמיחה של מיקרואורגניזם הוא מעוכב על ידי כל אחת מהתרכובות. הפרדות על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC) הן נוחים, כי תרכובות רבות יכולות להיות מופרדות על משטח מישורי. הפרדה מבוססת על קוטביות, עם כמה תרכובות מחייבות בחוזקה לבעלי כושר ספיגה (תאית במקרה של מחשב, ועוד מגוון של חומרי ספיחה במקרה של TLC) ונודדות פחות מאחרים 1. איור 1 מספק דוגמא למיקומים היחסי של תרכובות פנוליות קוטב ופולרי לאחר הפרדה על צלחת TLC סיליקה.
איור 1. דיאגרמה המדגימה הפצות של תרכובות של קטבים שונים לאחר הפרדה על chromatographic דק שכבה סיליקה צלחת (TLC). תרכובות פנול של תלתן אדום (Trifolium pratense L.) משמשות כדוגמא. תרכובות קוטביות, כגון clovamide, יש זיקה חזקה עבור בעלי כושר ספיגה קוטביים כמו סיליקה ולהישאר קרובים למקור (OR), ואילו תרכובות קוטביות פחות, כגון שלושה איזופלבונים קרובים לחזית הממס (SF), מחיצה יותר בקלות לממסים (שהם פחות קוטביים מסיליקה, אלא אם כן מים, חומצות, בסיסים או כלולים) ולהעביר הלאה את הצלחת.
לאחר ההפרדה של תמצית על צלחת TLC, יכולים להיחשף מיקרואורגניזמים מבחן לכל התרכובות על הצלחת, ובכך להאיץ את זיהוי של הרכיבים הפעילים של תמצית 2. אם תרבות פטרייתי או חיידקים חשופה להכרומתוגרמה, התפתחותם של חיידקים תתרחש בכל מקום פרט מעל אזורים עם צמיחת מעכביםתרכובות y. אזורים של עיכוב לאחר מכן ניתן לראות על ידי הניגוד בין צמיחת mycelial והאזורים ללא צמיחת פטריות אם כבר הוחלו 3 או על ידי ריסוס עם חומרים שמשנים את צבעם כאשר מופחת או הידרוליזה על ידי תאי חיים 4. למרות שימוש chromatograms נייר או בשכבה דקה למבחנים מיקרוביאלית יושם לראשונה לאנטיביוטיקה 5 וקוטלי פטריות 3,6, תמציות צמחים נמצאות כעת בתדירות גבוהה לגילוי תרכובות מיקרוביאלית בשיטה זו, המכונים לעתים קרובות bioautography. הפרוטוקולים שתוארו לעיל חלים על bioautography של chromatograms בשכבה דקה. TLC נעשה שימוש נרחב בגלל זה הוא מהיר יחסית ויכול להתבצע על חומרי ספיחה שונות (לדוגמא: סיליקה, עמילן, אלומינה), כמו גם לספק רזולוציה טובה ורגישות 1.
ניתן להכין תמציות צמחים לTLC בדרכים רבות. שיטות נפוצות כוללות חומר צמחי חילוץ בALCתערובות ohol מים כגון 80% אתנול 7,8, אולי עם התוספת של חומצה או בסיס 9. בעקבות מיצוי בממסים כאלה, המכילים מעט מים והם אולי חומצי או בסיסיים, תמציות חייבת להיות מרוכזות, כך שהם יכולים להיות מיושמים על צלחות TLC בנפח מינימאלי. הריכוז של תמציות אלכוהול מים יכול להיות מושגת על ידי החלוקה עם ממסים אורגניים במים immiscible 8 או בתערובת של ממסים כאלו, כגון אתר אתיל אצטט, אתיל (1:1, V / V) 10,11. מטבוליטים שונים של צמחים המחולצים לממסים אורגניים שונים, בהתאם לקוטביות שלהם. כדי להבטיח כי חומצות אורגניות צמח או בסיסים המחולצים לממסים אורגניים, בשלב זה, ה-pH של תמצית אלכוהול מים יכול להיות עלה או מונמכת עם חומצה מסיס במים או בסיס להמיר analytes ניתק לצורות nondissociated, אשר לאחר מכן מסיס בממסים אורגניים ניטראליים 9. לאחר מכן השלב האורגני יכול להיות דוארvaporated תחת לחץ מופחת או תחת חנקן ומותאם להיקף הרצוי עבור TLC. ה-pH של התמצית לא סביר שיהיה קטלני למיקרואורגניזמים מבדק בשל המחיצות של analytes לממסים ניטראליים, נפח סופי קטן, ואידוי של התמצית על צלחת TLC לפני ההפרדה.
פטריות וחיידקים שניהם מועסקים כמיקרואורגניזמים מבחן בbioautography של תמציות צמחים 2. נבגים של פטריות מסוימות, כגון cucumerinum Cladosporium, לנבוט על צלחות TLC (מלבד אזורים עם תרכובות מעכבות) אם ריססו על צלחות בפתרון תזונתי וטופחו בסביבה לחה במשך כמה ימים 3. התפטיר האפל של ג cucumerinum באזורי noninhibitory מספק ניגוד חריף לאזורים ללא צמיחה mycelial. למרות שחיידקים יושמו לכרומטוגרפיה בשכבה דקה צלחות (TLC) באותו אופן 4,12, חיידקים הם גם שפכו על TLCמשטחי צלחת אגרה שכבות 13,14. שמרים, כמו קנדידה אלביקנס, יכולים להיות מיושמים בשכבות אגר כמו גם 14. לחלופין, ניתן להציב צלחות TLC עם פנים כלפי מטה על גבי אגר מחוסן עם חיידקים או שמרי 10,15 8, בשיטה המכונה קשר bioautography 2.
אנו מתארים שיטה לbioautography מגע מסך עבור תרכובות פנוליות מיקרוביאלית מתלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland). מיקרואורגניזם המבחן הוא sticklandii Clostridium, חיידק כרס היפר לייצור אמוניה (HAB) ולחייב anaerobe. למרות הפרדות שימוש אינן פותרות את כל הרכיבים של התמצית, הם להקל על זיהוי של אזורים של פעילות מיקרוביאלית, ובכך מצמצם את הבריכה של תרכובות מיקרוביאלית אפשריות. הפרוטוקול מנצל נהלים סטנדרטיים ל1 TLC. הפרוטוקול מתאר גם כמה הטכניקות הנדרשות לobli culturingאנאירוביים שער עבור assay כגון, שימוש בקשר bioautography 15 ושיטת הדמיה עם מלח tetrazolium, אשר כתמי תאי חיים 2,4.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להפרדת תמצית לתוך תת קבוצות של תרכובות ומנסים לאמוד תת אלה על ידי bioautography ליצירת קשר. השיטה די דומה לזו ששמשה את Chomnawang et al. 15 למסך למטבוליטים צמח מעכבים לחיידקי גורמי זיבה. הסוג של bioautography המועסק מסך לתרכובות צמחים מיקרוביאלית תלו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר הנור טיילור המנוח, מח' צמח ומדעי קרקע באוניברסיטת קנטאקי, על שאפשרת לנו להשתמש בדגימות מחלקות התלתן האדומות שלו למחקר זה. פרויקט זה מומן על ידי ארצות הברית מחלקת החקלאות.
Materials
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 × 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 × 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50-µL syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µL. Alternative sources are equivalent. |
| micropipets | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 × 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2 HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4 H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6 H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2 H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. . Thin-layer chromatography. , (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 .
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 .
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. . The Organic Constituents of Higher Plants. , (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 .
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 .
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
