Tilstedeværelsen av høyrisiko HPV i hode og nakke svulstvev er forbundet med gunstige utfall. Den nylig utviklet RNA in situ hybridisering teknikk kalt RNAscope tillater direkte visualisering av HPV E6/E7 mRNA i FFPE vevssnitt.
Den "gullstandard" for onkogene HPV påvisning er demonstrasjonen av transcriptionally aktiv høyrisiko HPV i svulstvev. Men påvisning av E6/E7 mRNA ved kvantitativ revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR) krever RNA ekstraksjon som ødelegger svulstvev sammenheng avgjørende for morfologisk korrelasjon og har vært vanskelig å bli vedtatt i rutinemessig klinisk praksis. Vårt nylig utviklet RNA in situ hybridisering teknologi, RNAscope, tillater direkte visualisering av RNA i formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) vev med enkelt molekyl følsomhet og enkelt celle oppløsning, noe som gjør at svært sensitive og spesifikke in situ analyse av noe RNA biomarkør i rutinemessige kliniske prøver. Den RNAscope HPV assay ble utviklet for å detektere E6/E7 mRNA av syv høyrisiko HPV-genotype (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, og 58) ved hjelp av en dam av genotype-spesifikke prober. Det har vist utmerket følsomhetog spesifisitet mot strømmen "gullstandard"-metoden for å påvise E6/E7 mRNA ved QRT-PCR. HPV status bestemmes av RNAscope er sterkt prognostisk av kliniske utfall i orofaryngeal kreftpasienter.
Høyrisiko humant papillomavirus (HR-HPV) infeksjon utgjør ca 5% av alle krefttilfeller på verdensbasis en. Forekomsten av HPV-assosiert orofaryngeal kreft har økt i løpet av de siste tiårene, særlig blant menn. HPV-positive orofaryngeal plateepitelkarsinom (OPSCC) vil trolig utgjøre et flertall av alle hode og nakke kreft i USA i de neste 20 årene 2. Orofaryngeal plateepitelkarsinom forårsaket av HPV er assosiert med gunstige overlevelse, og svulst HPV status er en sterk og uavhengig prognostisk faktor for overlevelse tre.
Bevis for transkripsjonaktivering av de virale oncogener E6 og E7 er å anse som gullstandarden for nærvær av klinisk relevante HPV 4.. Imidlertid er påvisning av E6/E7 mRNA fra fersk svulstvev ved RT-PCR teknikken ikke praktisk i rutinemessig klinisk praksis og har vært begrenset til forskningslaboratoriene. Nylig, vi have utviklet en ny RNA ISH teknologi kalt RNAscope, noe som gjør at multiplex deteksjon i individuelle celler med én RNA-molekyl følsomhet i formalinfiksert parafin innebygde vevsprøver (FFPE) 5-10. Vi følger tre linjer av bevis for enkelt molekyl deteksjon fem. Først den RNAscope probe design og signalforsterkersystem tillatt påvisning av løssalgs HER2 genomisk DNA mål i HeLa og SK-BR-tre cellelinjer. For det andre, når sammenlignet med HER2 genomiske DNA-signaler, fordelingen av de fluoriserende intensiteter av HER2 mRNA-signal prikker i HeLa-cellene var i samsvar med ett molekyl pr dot. For det tredje, antall HER2 mRNA signal punkter per celle matchet tett HER2 mRNA kopi nummer anslått av en løsning basert kvantifisering analysen, ytterligere støtte single deteksjon molekyl. Videre gir kontra av atomkjerner med DAPI i fluoriserende mikroskopi eller med hematoxylin i lyse-feltet mikros visualisering av individuelle kjerner, which igjen tillater påvisning og kvantifisering av RNA mål på en encellet basis 10. Evnen til å analysere genuttrykk in situ i rutinemessige kliniske prøver gjør RNAscope en lovende plattform for diagnostisk patologi, spesielt de FFPE vevsnitt.F.eks-baserte analyser 10,11. Vi har utviklet en RNAscope basert analyse for å påvise HPV E6/E7 mRNA av syv høyrisiko HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 og 58) ved hjelp av en dam av genotype-spesifikke prober. Våre nyere studier i OPSCC har vist at RNAscope HPV-analysen er meget følsom og spesifikk i å bestemme HPV status på FFPE vev 12-17, og også informerer prognose i OPSCC 12,16.
Prinsippet om RNAscope teknologi har blitt beskrevet tidligere fem. Her beskriver vi den komplette RNAscope analyseprotokollen og demonstrere bruken ved påvisning av HR-HPV i FFPE tumor vev seksjoner.
Den RNAscope HPV-analysen tillot direkte visualisering av E6/E7 mRNA in situ i HPV-assosiert hode og nakke plateepitelkarsinom. Den RNAscope analysen er fullt kompatibel med rutinemessig fast svulstvev og bevarer vev morfologi for histopatologiske sammenhenger (figur 2). En viktig fordel med den RNAscope assay over konvensjonelle CISH metoder er at det spesifikt forsterker hybridiserings-signaler (figurene 2B og 2E) uten å forsterke bakgrunnsstøyen (figurene 2C og 2F).
I praksis kan den RNAscope HPV analyseprosedyren være fullført i løpet av 8 timer eller praktisk fordelt over to dager. Den RNAscope HPV-analysen har vært brukt til å bestemme HPV status i hode og nakke plateepitelkarsinom 12-16, viser 97% sensitivitet og 93% spesifisitet ved hjelp QRT-PCR som referansemetode 16. Konvensjonell chromogenic ISH for HR-HPV DNA er svært spesifikk, men har en sensitivitet på ~ 80% 12. Immunhistokjemisk (IHC) farging for den cellulære surrogatmarkør p16 demonstrerer utmerket følsomhet, men kan generere falske positive resultater 15,18, spesielt i nonoropharyngeal hode og nakke kreft 15. Den nåværende "gullstandarden" metode for QRT-PCR for HPV E6/E7 mRNA deteksjon krever fersk frosset vev for optimale resultater og er teknisk komplisert, noe som begrenser bruken til forskningslaboratoriet bare. I tillegg kreves det at RNA ekstraksjon som gjør det umulig å relatere HR-HPV E6/E7 mRNA uttrykk med histopatologi.
Det er flere viktige faktorer for å lykkes med den RNAscope analysen. Først, for best resultat, vev skal være løst i frisk 10% nøytral bufret formalin ved romtemperatur i 16-32 timer etter ASCO / CAP retningslinjer 19. For det andre er HybEZ ovnen anbefales siden det gjør det muligs optimal kontroll av temperatur og fuktighet for probe-hybridisering og signalforsterkningstrinn. For det tredje er det viktig å fjerne overskytende rest buffere før hvert trinn, men fortsatt holder vev-delen tørker i løpet av en hvilken som helst av disse trinnene.
Den manuelle RNAscope prosedyren som er beskrevet her er automatisert på en kommersiell lysbilde auto-farging system 10. Dette bør i stor grad forenkle standardisering av analyseforhold og sparer dyrebar manuelt arbeid i klinisk patologiske laboratorier. I tillegg har dedikert bildeanalyse programvare er utviklet 10 til automatisk identifisere cellene og farging signaler på en digitalisert lysbilde, som skal bidra til å eliminere subjektivitet og bedre reproduserbarhet i scoring.
I sammendraget, oppdager RNAscope HPV-analysen tilstedeværelsen av HR-HPV E6/E7 mRNA transkripsjoner in situ i FFPE vev. Den har en arbeidsflyt som er kjent for klinisk patologi laboraToryene ved å tillate direkte visualisering av disse i vev seksjoner. Det tilbyr en ideell plattform for å undersøke (FFPE) vevsprøver, og kan lett bli adoptert av diagnostisk patologi laboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Støttet delvis av NIH stipend (R43/44CA122444) og DOD BRCP stipend (W81XWH-06-1-0682) til YL.
SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit – Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
Cover Glass 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
Drying Oven | Capable of holding temperature at 60 ± 1°C | ||
Water Bath | Capable of holding temperature at 40 ± 1°C | ||