Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza
Summary
Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.
Abstract
Quadridimensionale (4D) immagini poco è stato utilizzato per studiare il comportamento di piccole strutture nel raggio di terminali dei nervi motori del sottile trasverso dell'addome muscolo del serpente giarrettiera. I dati grezzi comprende sequenze time-lapse di 3D z-stack. Ogni stack contiene 4-20 immagini acquisite con ottica epifluorescenza a piani focali separati da 400-1,500 nm. Passi nella acquisizione di pile di immagini, quali la regolazione della messa a fuoco, la commutazione di lunghezze d'onda di eccitazione, e il funzionamento della fotocamera digitale, sono automatizzate per quanto possibile per massimizzare la velocità di immagine e minimizzare danni ai tessuti da esposizione alla luce. Dopo l'acquisizione, una serie di pile di immagini è deconvolved per migliorare la risoluzione spaziale, convertito nel formato 3D desiderato, e utilizzato per creare un "film" 4D che è adatto per diverse analisi basati su computer, a seconda dei dati sperimentali richiesti. Una applicazione è lo studio del comportamento dinamico di due classi di endosomi trovati in terminali nervosi-macroendosomes (MES)e endosomi acidi (AES)-le cui dimensioni (200-800 nm per entrambi i tipi) sono in prossimità o al limite di diffrazione. L'accesso alle informazioni 3D in ogni tempo offre diversi vantaggi rispetto ai tradizionali time-lapse imaging. In particolare, le dimensioni e la velocità di movimento delle strutture possono essere quantificati nel tempo senza perdita di fuoco. Esempi di dati di immagini 4D rivelano che ME avvicinano alla membrana plasmatica e scompaiono, suggerendo che essi sono exocytosed piuttosto che semplicemente spostando verticalmente distanti un unico piano di messa a fuoco. Ha anche rivelato è la fusione putativo di ME e AES, attraverso la visualizzazione di sovrapposizione tra i due strutture colorante contenente come visto in ogni tre proiezioni ortogonali.
Introduction
Time-lapse imaging di tessuto vivente fornisce l'accesso visivo dinamici relazioni struttura-funzione che non può essere apprezzato in preparazioni fissi o che vivono impressi in un unico punto nel tempo. Spesso, tuttavia, il compromesso per l'accesso alle informazioni temporali è una diminuzione della risoluzione ottica. Obiettivi ad immersione in olio ad alta apertura numerica sono impraticabili nel tessuto vivo a causa della loro ristretta gamma di messa a fuoco, lasciando immersione in acqua o obiettivi a secco come le uniche alternative. Inoltre, la maggiore risoluzione ottenibile con ottica confocale non può essere utilizzato in alcune preparazioni vivere a causa della fototossicità dai livelli relativamente alti di illuminazione richiesti 1,2. Infine, mentre diverse real-time o time-lapse tecniche ottiche sono disponibili che offrono una maggiore risoluzione, la loro applicabilità è limitata a preparazioni in cui le strutture di interesse possono essere posizionati a poche centinaia di nanometri dell'obiettivo 1. Il metodo descritto, a strumenti relativamente a basso costo, è versatile, ma offre una migliore risoluzione rispetto alle tecniche time lapse più comunemente usati. Esso è destinato all'uso nei laboratori individuali nonché strutture di imaging.
Il metodo utilizza epifluorescenza convenzionale, combinato con una fotocamera digitale sensibile e con hardware progettato per acquisire rapidamente gruppi di immagini a leggermente differenti piani focali (Z-stack). Ogni z-stack è digitalmente deconvolved per aumentare la risoluzione. Una caratteristica del 3D time-lapse (4D) imaging è tracciamento preciso di organelli o altre strutture in movimento. Se correttamente impostato, strutture impressi non vanno fuori fuoco, e il movimento in tutte e tre le direzioni possono essere osservati e quantificati. Così è impossibile per una struttura macchiato eliminata nell'arco di uno o più frame time lapse semplicemente alla deriva sopra o al di sotto di un piano focale stretta. Il metodo serve anche come strumento sensibile per valutare le interazioni e possibile fusione di piccole strutture. Epifluorescenza convenzionale o immagini confocali di strutture in prossimità del limite di diffrazione (a poche centinaia di nm) non confermano la fusione anche se le immagini mostrano unite sovrapposizione delle rispettive etichette 3. Fusion è suggerito, ma rimane la possibilità che gli oggetti sono separati orizzontalmente o verticalmente da una distanza che è inferiore al limite di diffrazione. Tre o immagini quadridimensionale, al contrario, consente la visualizzazione degli oggetti in ciascuna delle tre direzioni ortogonali. L'aspetto della fusione in tutte e tre le viste aumenta il livello di certezza. E, in alcune preparazioni viventi, diretto o moto browniano di oggetti ipoteticamente fuse fornisce un'ulteriore prova quando entrambi i marchi si muovono insieme nel tempo. Naturalmente, quando in prossimità del limite di diffrazione il livello di certezza in strutture esigenti da sfondo, o mostrando che esse contengono due coloranti (fusione), non è assoluto. Se, tecniche specializzate, ad esempio la risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET)4, sono più appropriato.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'aspetto più critico dell'imaging 4D è la gestione della durata e intensità di esposizione alla luce. Fotoscolorimento diminuisce immagine rapporto segnale-rumore e può essere problematico o meno a seconda di vari fattori, tra cui la scelta di fluorofori. Danni aspecifica di tessuto vivente (fototossicità) è legato alla photobleaching, e talvolta può essere identificato utilizzando sonde fluorescenti progettati per lo scopo 2,12 o di un esame della morfologia con opportune ottiche chiaro, come…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant NS-024572 (da RSW).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
References
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