على الإحاطة الفحص: بروتوكول لتقييم التفاعلات بين الخلايا العصبية والجهاز العصبي المركزي البالعات
Summary
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع قدرة عالية على يبلعم أو تبتلع المواد في بيئتهم خارج الخلية. هنا، يوصف مقايسة المطبقة على نطاق واسع وموثوق بها، والكمية غاية لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة بابتلاعها من مكونات متشابك.
Abstract
البلعمة هي العملية التي خلية تبتلع المواد (الخلية بأكملها، وأجزاء من خلية، والحطام، وغيرها) في البيئة خارج الخلية المحيطة بها وبالتالي يساعد على هضم هذه المواد، عادة من خلال تدهور الليزوزومية. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والتي تم وصفها في مجموعة واسعة من الشروط من مرض الاعصاب (على سبيل المثال، والتخليص بيتا اميلويد في مرض الزهايمر) لتطور الدماغ صحية (على سبيل المثال، متشابك وظيفة البلعمة التقليم) 1-6. بروتوكول التالية هي فحص الإحاطة وضعت لتصور وقياس بوساطة الخلايا الدبقية الصغيرة الإحاطة المدخلات قبل المشبكي في الماوس تطوير نظام retinogeniculate 7. في حين تم استخدام هذا الاختبار لتقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا السياق على وجه الخصوص، يمكن استخدام نهج مماثل لتقييم البالعات الأخرى في جميع أنحاء الدماغ (مثل الخلايا النجمية) وباقي الجسم(على سبيل المثال، الضامة الطرفية)، وكذلك السياقات الأخرى التي يحدث فيها إعادة عرض متشابك (على سبيل المثال، إصابات الدماغ / مرض).
Introduction
الدوائر متشابك يعيد طوال حياة الحيوان. في الدماغ النامية، تشكل نقاط الاشتباك العصبي في الزائدة ويجب أن تخضع التقليم متشابك الذي ينطوي على إزالة انتقائية من مجموعة فرعية من نقاط الاشتباك العصبي وصيانة وتعزيز نقاط الاشتباك العصبي من تلك التي لا تزال 8-10. هذه العملية ضرورية لتحقيق سمة الربط الدقيق للنظام العصبي الكبار. في البالغين، ويمكن أيضا أن تكون نقاط الاشتباك العصبي البلاستيكية، ولا سيما في سياق التعلم والذاكرة. يعتقد أن يرتبط هذا اللدونة الهيكلية لتشمل إضافة و / أو القضاء على العمود الفقري شجيري وحبات قبل المشبكي 11-13. بالإضافة إلى هذه الأدوار في سلامة الجهاز العصبي، وتشارك أيضا في إعادة عرض متشابك العصبي مرض 12،14،15 نظام / إصابة. على سبيل المثال، بعد إصابة الحبل الشوكي، يجب إعادة تشكيلها في وقت لاحق قطعت محاور وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية جديدة لتحقيق الانتعاش 16-19.
الإقليم الشمالي "> الناشئة كجانب هام من اللدونة متشابك هو عملية البلعمة أو الابتلاع من نقاط الاشتباك العصبي متجهة لإزالة 3،5،20. أظهرنا مؤخرا هذه الظاهرة في سياق التقليم متشابك في صحية، وبعد الولادة مخ الفأر 7. على وجه التحديد ، الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا الجهاز العصبي المركزي وجهاز المناعة البالعات المقيمين عرضت، لتبتلع المدخلات قبل المشبكي خلال فترة الذروة وفي منطقة التقليم متشابك التنموية، والظهرية الجانبية بعد الولادة الركبي النواة (dLGN) من المهاد. الحصار الوراثية أو الدوائية من هذا الغمر أسفرت عن العجز المستمر في اتصال متشابك.في هذا البروتوكول، ونحن تصف مقايسة موثوقة والكمي للغاية لقياس بوساطة بلعمية الإحاطة المدخلات قبل المشبكي. لأغراض هذه المادة، وسيقدم هذا الاختبار في سياق منظومة تطوير retinogeniculate، والذي يتضمن خلايا الشبكية العقدة (RGCs) المقيمين في شبكية العين التيمشروع المدخلات قبل المشبكي إلى dLGN (الشكل 1A). لتبدأ، وسوف يمكن وصفها استراتيجية وضع العلامات تقدمي مقاومة للتدهور الليزوزومية، والذي يستخدم لتصور المدخلات قبل المشبكي RGC محددة في dLGN (الشكل 1) 7،21. بعد هذا الوصف، منهجية مفصلة للتصوير وقياس كميا الغمر باستخدام المجهر متحد البؤر جنبا إلى جنب مع 3 الأبعاد (3D) حجم سطح التقديم سوف تعطى. ويستند هذا المنهج على إعداد الأنسجة ثابتة ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لاستخدامها في دراسات التصوير الحي. الأهم من ذلك، في حين تم التحقق من صحة الفحص في سياق صحي، ونظام retinogeniculate ما بعد الولادة، يمكن للمرء أن يطبق نفس الأساليب الأخرى لتقييم التفاعلات بلعمية الخلايا العصبية في جميع أنحاء الدماغ وأثناء المرض، فضلا عن وظيفة بلعمية في أجهزة الجسم الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل قياس بدقة البلعمة، ويجب أن يكون المسمى المواد غارقة في مثل هذه الطريقة التي يمكن للباحث تصور مرة واحدة حدث تدهور الليزوزومية. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب عالية الدقة والتصوير، تليها استخدام البرمجيات التي تمكن الباحث لتصور حجم الخلية بأكملها وتحديد محتوياته. في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد العمل من المنح المقدمة من مؤسسة سميث الأسرة (BS)، ومؤسسة دانا (BS)، جون برنامج علماء ميرك (BS)، NINDS (RO1-NS-07100801؛ BS)، NRSA (F32-NS-066698؛ DPS)، نانسي لوري ماركس مؤسسة (DPS)، المعاهد الوطنية للصحة (P30-HD-18655؛ MRDDRC التصوير الأساسية).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer’s disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington’s disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
