Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas
Summary
La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) con una alta capacidad de fagocitar o material de envolver en su entorno extracelular. Aquí, se describe un ensayo ampliamente aplicable, fiable, y altamente cuantitativo para visualizar y medir la microglia mediada por inmersión de componentes sinápticas.
Abstract
La fagocitosis es un proceso en el que una célula envuelve el material (célula entera, partes de una célula, escombros, etc) en su entorno extracelular que rodea y posteriormente se digiere este material, comúnmente a través de la degradación lisosomal. La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) cuya función fagocítica se ha descrito en una amplia gama de condiciones de enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, aclaramiento de beta-amiloide en la enfermedad de Alzheimer) para el desarrollo del cerebro sano (por ejemplo, sináptica poda) 1-6. El siguiente protocolo es un ensayo de inmersión desarrollado para visualizar y cuantificar inmersión microglia mediada de insumos presinápticas del sistema retinogeniculadas ratón en desarrollo 7. Mientras que se utilizó este ensayo para evaluar la función microglia en este contexto particular, un enfoque similar se puede utilizar para evaluar otros fagocitos en todo el cerebro (por ejemplo, astrocitos) y el resto del cuerpo(por ejemplo, macrófagos periféricos), así como otros contextos en los que ocurre la remodelación sináptica (por ejemplo, lesión cerebral / enfermedad).
Introduction
Circuitos sinápticos remodelar largo de la vida de un animal. En el cerebro en desarrollo, las sinapsis se forman en exceso y deben someterse a la poda sináptica que consiste en la eliminación selectiva de un subconjunto de las sinapsis y el mantenimiento y fortalecimiento de esas sinapsis que permanecen 8-10. Este proceso es necesario para lograr la conectividad característica precisa del sistema nervioso adulto. En el adulto, las sinapsis también pueden ser de plástico, en particular en el contexto del aprendizaje y la memoria. Las correlaciones estructurales de esta plasticidad se cree que incluyen la adición y / o eliminación de las espinas dendríticas y presináptica boutons 11-13. Además de estas funciones en el sistema nervioso saludable, remodelación sináptica también está implicada en la enfermedad del sistema nervioso 12,14,15 / lesión. Por ejemplo, después de una lesión de la médula espinal, los axones cortados deben posteriormente remodelar y formar nuevas sinapsis para lograr la recuperación funcional 16-19.
nt "> Emergiendo como un aspecto importante de la plasticidad sináptica es el proceso de la fagocitosis o la inmersión de las sinapsis con destino a la eliminación 3,5,20. Recientemente, hemos mostrado este fenómeno en el contexto de la poda sináptica en el sano, el cerebro postnatal ratón 7. Específicamente , microglía, las células inmunes residentes del SNC y los fagocitos, se muestra para engullir entradas presinápticas durante un período de pico y en una región de la poda sináptica de desarrollo, el dorsal posnatal núcleo geniculado lateral (dLGN) del tálamo. bloqueo genética o farmacológica de esta inmersión traducido en déficits sostenidos en la conectividad sináptica.En este protocolo, se describe un ensayo fiable y altamente cuantitativo para medir la inmersión fagocítica mediada de insumos presináptica. A los efectos de este artículo, este ensayo se presentará en el marco del sistema de desarrollo de retinogeniculadas, que incluye las células ganglionares de la retina (CGR) que reside en la retina queproyectar entradas presináptica a la dLGN (Figura 1A). Para empezar, una estrategia de marcaje anterógrado resistente a la degradación lisosomal se describirá, que se utiliza para visualizar entradas presinápticas RGC-específicos en la dLGN (Figura 1) 7,21. Después de esta descripción, una metodología detallada para la imagen y la medición cuantitativa de inmersión utilizando microscopía confocal combinadas con 3 dimensiones (3D) de superficie representación de volumen se le dará. Esta metodología se basa en la preparación del tejido fija, pero también puede ser adaptado para su uso en estudios de formación de imágenes en vivo. Es importante destacar que, mientras que el ensayo ha sido validado en el contexto del sistema de retinogeniculadas saludable, posnatal, se podría aplicar las mismas técnicas para evaluar otras interacciones fagocito-neuronas en todo el cerebro y durante la enfermedad, así como la función fagocítica en otros sistemas de órganos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el fin de medir con precisión la fagocitosis, el material engullido debe etiquetarse de tal manera que el investigador puede visualizar una vez se ha producido la degradación lisosomal. Además, se requiere formación de imágenes de alta resolución, seguido por el uso de software que permita el investigador para visualizar el volumen de toda la célula y cuantificar su contenido. En este protocolo, se describe un método altamente fiable y cuantitativa para medir la inmersión de los fagocitos mediada por el uso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Smith Family (BS), la Fundación Dana (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (SR1-NS-07100801; BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Fundación Lurie Marks (DPS), el NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer’s disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington’s disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
