Modélisation spontanée carcinome rénal métastatique (MRCC) chez des souris après néphrectomie

Summary

Les modèles de métastases de carcinome à cellules rénales (RCC), la progression de la maladie spontanée peuvent être utilisées pour l'évaluation des traitements dans un cadre clinique. Ce protocole illustre différentes procédures d'implantation orthotopique de cellules de tumeur du rein, une néphrectomie proprement dit, et présente enfin un guide de notation visuelle de l'autopsie et bioluminescent de charge métastatique et de la localisation.

Abstract

L'un des principaux obstacles à l'amélioration de l'essai de nouveaux traitements expérimentaux dans le carcinome à cellules rénales (RCC) est le développement de modèles qui récapitulent fidèlement la progression de la maladie métastatique précoce et à un stade avancé. Des modèles d'implantation de la tumeur typiques utilisent implantation de la tumeur primaire ectopique ou orthotopique, mais peu comprennent la maladie métastatique spontanée systémique qui imite l'environnement clinique. Ce protocole décrit les principales étapes pour développer la progression de la maladie RCC met en scène similaire aux patients. En premier lieu, il utilise une lignée de cellules de tumeur de souris hautement métastatique dans un modèle orthotopique syngénique pour montrer l'implantation des cellules tumorales. Les méthodes comprennent l'implantation superficielle et interne dans l'espace sous-capsulaire avec des cellules associées à matrigel pour éviter les fuites et la propagation rapide. Ensuite, il décrit les procédures pour l'excision de la tumeur portant rein (néphrectomie), les soins de la souris pré-et post-opératoire critique. Enfin, il décrit les étapes nécessaires pour surveiller et évaluermicro-et macro progression de la maladie métastatique, y compris l'imagerie de bioluminescence ainsi fournit un guide détaillé de l'autopsie visuelle de marquer distribution de la maladie systémique. Le but de cette description du protocole est de faciliter l'utilisation généralisée de modèles de CCR métastatiques cliniquement pertinentes pour améliorer la valeur prédictive du test thérapeutique futur.

Introduction

La principale cause de mortalité chez les patients atteints de carcinome à cellules rénales (RCC) est une maladie métastatique systémique qui se produit généralement après l'élimination chirurgicale d'une tumeur primaire de plus en plus dans le rein. Cependant, très peu de modèles précliniques de tumeurs évaluation thérapeutique expérimentale chez la souris incluent la maladie métastatique, et encore moins récapitulent fidèlement les stades cliniques de croissance localisée, la chirurgie et l'initiation et la progression ^1-3 micro-métastatique spontanée. Cet écart dans les tests est devenu de plus en plus important dans l'évaluation de nouvelles thérapies car parfois saisissants effets anti-tumeurs observés chez des modèles animaux ne sont pas toujours traduits dans le traitement similaire de patients avec succès ^4. Ces différences de résultats peuvent provenir d'efficacités de drogue différentiels entre les modèles extra-utérines ou orthotopiques localisées tumeur primaire et à un stade avancé métastatique ^5-7. Dans le cas de RCC, seules quelques études ont établi un employéNimal protocoles qui incluent la maladie récurrente spontanée qui imite les patients qui ont eu généralement reins porteuses de tumeurs retirées totalement ou partiellement ^{de 2,3.} Les raisons de cette pénurie dans les tests de modèle de souris varient. Tout d'abord, il est le coût élevé des animaux et de la variabilité inhérente à la sélection de cellules de tumeur et son potentiel métastatique. Par exemple, des lignées de cellules de rein humain ont tendance à former des métastases rarement, et doivent être choisis sur des cycles multiples de l'implantation primaire orthotopique et sélection métastatique de dériver des variants qui diffusent de manière cohérente et forment des lésions éloignés (voir la description d'un tel dérivé de lignée cellulaire humaine ^8-10) . A l'inverse, des cellules de souris dans des modèles immunocompétents ont tendance à se comporter de manière agressive, et un faible nombre de cellules doivent être injectés avec matrigel à réduire la propagation systémique immédiate ^3. Deuxièmement, des difficultés techniques dans l'exécution de l'implantation proprement dite, la résection chirurgicale (néphrectomie), et suivi (et quantification) metastati spontanéela croissance c peut être difficile et plusieurs variables critiques besoin considération lors de l'utilisation de cette technique (voir discussion pour plus de détails). Le but de ce protocole est de décrire les étapes essentielles (ainsi que les pièges potentiels) d'implantation orthotopique, la résection (néphrectomie), et la surveillance de la maladie spontanée RCC métastatique et d'offrir une ligne directrice pour standardisée (et plus largement) utiliser les laboratoires scientifiques qui évaluent l'efficacité des traitements expérimentaux.

Protocol

1. Orthotopique tumeur du rein Implantation Culture cellulaire Avant l'implantation orthotopique, cultiver des cellules de souris RENCA LUC comme une monocouche à 75% de confluence. À la suite de traitement à la trypsine et de la remise en suspension dans des milieux contenant du FBS à 5%, les cellules de centrifugation à 1000 tpm, 4 ° C pendant 5 minutes, en répétant trois fois pour laver dans du PBS. Puis remettre en suspension les cellules dans des milieux sans sé…

Representative Results

La figure 1A montre un schéma décrivant les procédures décrites dans ce résumé du protocole. Plusieurs facteurs importants doivent être pris en considération à chaque étape. Par exemple, dans l'étape 1, on montre deux méthodes pour l'implantation des cellules tumorales sous-capsulaire dans le rein. Les cellules tumorales peuvent être implantés dans l'espace sous-capsulaire avec un petit blanc-bulle confirmant le placement localisée des cellules avec fuite empêché par l'?…

Discussion

Le but de ce protocole est d'évaluer la maladie métastatique spontanée cliniquement pertinente en utilisant un modèle de souris de tumeur syngénique à décrire les techniques d'implantation / de résection. Actuellement, la majorité des études précliniques évaluant de nouveaux traitements expérimentaux ne comprend pas l'étude de la maladie métastatique et seulement quelques-uns récapituler les étapes de la croissance de la tumeur primaire, la résection chirurgicale, et une éventuelle dissém…

Materials

DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine	Corning	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% Trypsin EDTA	Corning	25-053-CL
1x DPBS without Calcium & Magnesium	Corning	21-031-CV
Matrigel	BD Biosciences	354234	must be kept on ice
Artifical tears-lubricant opthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-162-35
Pocket pro pet trimmer	Braintree scientific	CLP9931B
Alcohol swab	VWR	326895
Betadine solution swab	VWR	67618-152-01
MICRO DISSECTING sissors straight,blunt – 25mm blades – 4.5"	Southpointe surgical	RS-5982
Iris Forceps, serrated, curved, 10cm long	Kent scientific	INS15915	need two of these
10µl Hamilton syringe	Hamilton	7635-01
30G, 45 degree, RN needle	Hamilton	7803-07
Sterile cotton tipped appicator	VWR	10805-144
High temperature cautery kit	Kent scientific	INS500392
5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle	Ethicon	J834
Reflex clip applier for 7mm clips	Kent scientific	INS500343
Reflex clips, 7mm, non-sterile	Kent scientific	INS500344
Removing forceps, 12cm lone	Kent scientific	INS500347
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare	2B1322
Buprenorphine 0.01mg/mL
25G 5/8" needle	VWR	BD305122
1mL syringe w/out needle	VWR	BD309659
D-Luciferin	Gold Bio technology	LUCK-1G