Hot Biologische Katalyse: Isotherme Titrationskalorimetrie zu Enzymreaktionen Charakterisieren
Summary
Isotherme Titrationskalorimetrie Maßnahmen Wärmestrom freigegeben oder in chemischen Reaktionen absorbiert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Enzym-Katalyse zu quantifizieren. In diesem Papier, das Protokoll für die Instrumental Setup-Experiment läuft, und Datenanalyse wird allgemein beschrieben, und der Charakterisierung der enzymatischen Hydrolyse von Harnstoff Bohne Urease aufgebracht.
Abstract
Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist eine gut beschriebene Technik, die die Wärme freigesetzt oder während einer chemischen Reaktion aufgenommen, sie als eine intrinsische Sonde zur Charakterisierung praktisch jeden chemischen Prozess misst. Heutzutage wird dieses Verfahren weitgehend angewendet, um thermodynamische Parameter des biomolekularen Bindungsgleichgewichte bestimmen. Zusätzlich ITC wurde gezeigt, können direkt zu messen Kinetik und thermodynamischen Parameter (k cat, K M, &Dgr; H) von enzymatischen Reaktionen, obwohl diese Anwendung noch unzureichend genutzt werden. Als Wärme Änderungen spontan während der enzymatischen Katalyse kommen, die jedoch ITC keine Änderung oder die Kennzeichnung des Systems unter Analyse bedürfen und kann in Lösung durchgeführt werden. Darüber hinaus muss das Verfahren wenig Materialmenge. Diese Eigenschaften machen ITC eine unschätzbare, leistungsstarke und einzigartige Werkzeug zur Enzymkinetik in mehreren Anwendungen, wie zum Beispiel, Arzneimittelforschung studieren.
<p class = "jove_content"> In dieser Arbeit eine experimentelle ITK-basierte Methode zur Kinetik und Thermodynamik enzymatischer Reaktionen zu quantifizieren, wird gründlich beschrieben. Dieses Verfahren wird angewendet, um zu bestimmen, k cat und K M der enzymatischen Hydrolyse von Harnstoff durch Canavalia ensiformis (jack bean) Urease. Berechnung der intrinsischen molare Enthalpie (&Dgr; H int) der Reaktion durchgeführt. Die so erhaltenen Werte sind konsistent mit früheren Daten in der Literatur berichtet, was die Zuverlässigkeit der Methode.Introduction
Quantitative Bestimmung von biochemischen Reaktionen Einblicke in die biologischen Prozesse auf der Grundlage des Lebens. Kalorimetrie bietet eine markierungsfreie Methode zur quantitativen Charakterisierung praktisch jede chemische Reaktion in Lösung. Dieses Verfahren misst die Wärme freigegeben oder im Laufe der Zeit absorbiert wird, und ist daher eine universelle Erfassungssystem und eine sehr bequeme Methode, um die Menge der reagierenden Moleküle (dh Bindung Thermodynamik), als auch die Reaktionsgeschwindigkeit (dh Kinetik) messen zu quantifizieren. Insbesondere hat isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) als Methode der Wahl, um die Thermodynamik der biomolekularen Gleichgewichte zu charakterisieren, mit Protein-Ligand-Protein-Protein, Protein-Metallionen und Protein-DNA-Wechselwirkungen 6.1 verabschiedet. Darüber hinaus ist die Fähigkeit des ITC, um kinetische Informationen ist es ein sehr leistungsfähiges System zur Enzymkatalyse zu messen, obwohl das Potenzial dieser Anwendung ist nochunterschätzt 09.07.
Die Michaelis-Menten-Gleichung 10 ist eine quantitative Beschreibung von enzymatischen Reaktionen, da es eine Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Substratkonzentration, in Abhängigkeit von zwei kinetischen Parameter: die Michaelis-Konstante (K M) und die katalytische Geschwindigkeitskonstante (k cat) . Die k cat / K M-Verhältnis ist als das katalytische Effizienz eines Enzyms bezeichnet. In der Praxis Bestimmung von K M und k cat für eine bestimmte Reaktion eine vollständige Beschreibung der Katalyse.
In einem typischen Enzymreaktion (Abb. 1), einem Substrat (S) mit dem Enzym (E) die Enzym-Substrat-(ES)-Komplex gebildet wird, der anschließend in den Übergangszustand aktiviert wird (ES *). Letzteres wird in das Enzym-Produkt (EP)-Komplex dissoziiert, die schließlich umgewandelt. Diese Schritts werden durch die folgende Reaktion beschrieben.
(1)
k 1 die Geschwindigkeitskonstante für die Bildung des Komplexes ES, k-1 die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation des Komplexes ES, während k cat ist die katalytische Geschwindigkeitskonstante oder Umsatzzahl.
: Gemäß der Michaelis-Menten-Gleichung 10 kann die Geschwindigkeit der Reaktion berechnet werden
(2)
wobei K = M (k-1 + k cat) / k 1 und k cat = v max / [E], wobei V max die maximale Geschwindigkeit erreicht, wenn alle Enzyms an das Substrat gebunden.
Die isotherme Titrationskalorimeter ist das Instrument in dieser Studie verwendet, um die enzymatische Hydrolyse von Harnstoff zu charakterisieren. Dieses Instrument besteht aus einem adiabatischen Abschirmung, die zwei geprägte förmigen Zellen (Fig. 1) hergestellt. Diese sind nach außen mit schmalen Zugang Rohren verbunden. Die Probenzelle (ca. 1,4 ml) wird mit der Enzymlösung beladen, und die Referenzzelle wird in der Regel mit Wasser oder mit der für die Analyse verwendeten Lösungsmittel gefüllt. Eine rotierende Spritze mit langer Nadel und einem Rührstäbchen Paddel befestigt ist, die gewöhnlich ca. 0,3 ml Substratlösung wird auf die Probenzelle montiert. Eine thermoelektrische Vorrichtung mißt die Temperaturdifferenz zwischen der Probe und der Referenzzelle und mit einem "Zellrückkopplungsnetzwerk", behält er diese Differenz auf Null durch Addieren oder Subtrahieren Wärme. Während des Experiments wird das Substrat in der Enzymlösung bei einem konstanten gewählten Temperatur eingespritzt. Wenn die enenzymatische Reaktion stattfindet, die Menge an Wärme freigesetzt oder absorbiert wird, ist proportional zu der Anzahl von Substratmolekülen, die in Produktmoleküle umgewandelt werden. Darüber hinaus ist die Wärmestromrate direkt mit der Geschwindigkeit der Reaktion stehen. Die gemessenen Daten, wie eine Abweichung der Spur von der ersten Wärmegrundlinie (Fig. 1) erscheinen, (μcal / sec) durch das Instrument auf die Probenzelle, die proportional zu der in der Probenzelle auftretenden Wärmestrom versorgt sind der thermische Leistungs über die Zeit.
Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der isothermen Titrationskalorimeter um enzymatische Reaktionen zu untersuchen. Einer enzymatischen Reaktion bei der Titration des Substrats (in der Injektionsspritze) auftritt in die Enzymlösung (in der Probenzelle) zu einer Änderung der thermoFehlleistung durch das Kalorimeter, notwendig, um die Temperaturdifferenz zwischen der Probenzelle und der Referenzzelle konstant zu halten veröffentlicht. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Insgesamt ist die Wärmeänderung (Q) proportional zum molaren Enthalpie der Reaktion (AH) und der Anzahl von Molen des Produkts erzeugt (n), die wiederum durch den Gesamtvolumen-fache der Konzentration gegeben:
(3)
Die Produktbildung über die Zeit (dP / dt), die die Reaktionsgeschwindigkeit entspricht, kann somit der Wärmemenge über die gleiche Zeit (dQ / dt) durch die Beziehung erzeugt verwandt sind:
(4)
Nach dieser Gleichung um eine Michaelis-Menten-Plot zu erhalten ist es notwendig, zu messen i) die Gesamtstoff Enthalpie AH, und ii) der Wärmestrom dQ / dt bei verschiedenen Substratkonzentrationen. Gewöhnlich wird dies auf zwei verschiedene Experimente durchgeführt: Im ersten Versuch (Methode 1, M1), wird das Substrat in der Enzymlösung injiziert und die Wärme zur vollständigen Substratumsatz gemessen wird; in dem zweiten Experiment (Methode 2, M2), werden mehrere Injektionen des Substrats durchgeführt und die Rate der Wärmeerzeugung bei verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen. Diese zwei Sätze von Daten ausreichend sind, um die kinetischen Parameter K m und k cat abzuleiten.
Im vorliegenden Artikel wird eine allgemeine Protokoll, um die kinetischen Parameter für enzymatische Reaktionen unter Verwendung von ITC bestimmen beschrieben. Wir wendeten die Methode zur Harnstoff-Hydrolyse durch Canavalia ensiformis Harnstoffse als Bezugssystem. Die gute Übereinstimmung zwischen den mit dieser Methode erzielten Ergebnisse sowie die in der Literatur berichtet Daten zeigen die Zuverlässigkeit dieses Ansatzes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bedeutung der ITC, um die enzymatische Aktivität gegenüber bestehenden Methoden zu studieren
Zusätzlich zu den klassischen Anwendungen, verbindliche Gleichgewichte zu untersuchen, bietet isothermen Titrationskalorimetrie eine zuverlässige und schnelle Methode, um enzymatische Reaktionen in Lösung charakterisieren, mit der Reaktionswärme als Sonde, ohne Systemänderung oder die Kennzeichnung erfordern. Die kinetischen Parameter k cat und K M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Spezialdünger Products Company (SFP) ist für die Bereitstellung der erforderlichen Mittel für diese Studie bestätigt.
Materials
| HEPES | Sigma | H3375 | dissolving in water and adjusting pH with NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | dissolving in water and adjusting pH with HCl |
| Sodium dihydrogen phosphate | Riedel-de-Haen | 4270 | dissolving in water |
| Sodium phosphate dibasic | Riedel-de-Haen | 30427 | dissolving in water |
| Urea | Sigma | U4128 | dissolving in water at 40 °C |
| Canavalia ensiformis urease (type C-3) | Sigma | U0251 | dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C |
| VP-ITC on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | instrument |
| VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | data acquisition software supplied with the instrument |
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