تشكيل غشاء حيوي ميكروأرس مع الطريقة الجمعية مقرها الممسحة-
Summary
طبقات ثنائية الدهون بدعم والجزيئات الغشاء الطبيعية هي أنظمة مريحة التي يمكن تقريب خصائص أغشية الخلايا وإدراجها في مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات التحليلية. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لإعداد ميكروأرس تتكون من أيد الدهون المغلفة طبقة ثنائية شافي 2 حبات، حويصلات فوسفورية أو جزيئات الغشاء الطبيعية.
Abstract
الأغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية تشكل أغشية البلازما من الخلايا وتحديد العضيات التحت خلوية حدود. في الطبيعة، وهذه الأغشية هي مزيج غير متجانس من العديد من أنواع الدهون، وتحتوي على بروتينات غشاء محدد وزينت مع الكربوهيدرات. في بعض التجارب، فمن المستحسن أن فصل الخصائص الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية أو من طبقة ثنائية المادة الدهنية من تلك الغشاء الطبيعية. مثل هذه الحالات تدعو إلى استخدام نظم نموذج مثل حويصلات العملاقة، الجسيمات الشحمية أو طبقات ثنائية الدهون المدعومة (SLBs). صفائف SLBs جذابة بشكل خاص للتطبيقات الاستشعار عن بعد ومحاكاة التفاعلات خلية خلية. نحن هنا تصف طريقة جديدة لتشكيل المصفوفات SLB. والمغلفة Submicron قطرها شافي 2 حبات الأولى مع طبقات ثنائية الدهون لتشكيل SLBs كروية (SSLBs). ثم تترسب حبات في مجموعة من microwells submicron ذات القطر الصغير التجهيز. يستخدم تقنية التحضير ل"ممسحة" لتنظيف سطح الركيزة، في حين اغادرز وراء SSLBs التي استقرت في microwells. يتطلب هذا الأسلوب أي تعديل الكيميائية الركيزة microwell، ولا أي بروابط تستهدف بشكل خاص على SSLB. ويشغل Microwells بواسطة الخرز واحد لأن يتم ضبطها قطر جيدا أن مجرد أكبر من قطر حبة. عادة، يتم المحتلة أكثر من 75٪ من الآبار، في حين أن بقية تبقى فارغة. في المخزن عرض صفائف SSLB الاستقرار على المدى الطويل من الاسبوع أكبر من واحد. أنواع متعددة من SSLBs يمكن وضعها في مجموعة واحدة عن طريق ترسب المسلسل، وصفائف يمكن استخدامها للاستشعار، والتي علينا أن نظهر من خلال تميز تفاعل بكتيريا الكوليرا مع غانغليوزيد GM1. وتبين لنا أيضا أن الحويصلات فوسفورية دون الدعم حبة وbiomembranes من مصادر الخلوية يمكن المحتشدة مع نفس الأسلوب ويمكن تحديد نسبة الدهون في غشاء الخلية محددة.
Introduction
الأغشية الدهنية طبقة ثنائية هي هياكل الأساسية في الطبيعة. وتتكون الأغشية الخلوية والأغشية البلازما عضية من طبقات ثنائية الدهون التي تضم عددا من الجزيئات التي هي ضرورية للحياة. تحدث العديد من العمليات إدامة الحياة على سطح الخلايا أو بوساطة الجزيئات المرتبطة الأغشية الدهنية، طبقة ثنائية. في الواقع، تم العثور على العديد من الأدوية العمليات المستهدفة أو الجزيئات أو في الأغشية 1،2. وبالتالي فإنه من الضروري التحقيق في العمليات التحليلية، مثل التفاعلات الكيميائية أو الأحداث ملزمة noncovalent التي تحدث على أسطح الأغشية. لأن الأغشية الطبيعية يمكن أن يكون من الصعب عزل و / أو التفاعل مع أجهزة الاستشعار، والعديد من الباحثين استخدام الأغشية نموذج مبسط لإجراء دراسات تحليلية. ووصف عدد من أنظمة غشاء نموذج في الأدب، بدءا من حويصلات العملاقة التي يمكن أن يكون عشرات ومئات من ميكرون في القطر إلى الجسيمات الشحمية ذات أبعاد النانو 3،4. Alternatively، طبقات ثنائية مستو الدهون تترسب على الدعم الصلبة، أي بدعم طبقات ثنائية الدهون (SLBs)، يمكن تشكيلها على عدد من الأسطح المختلفة، واستخدمت على نطاق واسع في التطبيقات الفيزيائية الحيوية، والكيمياء الحيوية، والتحليلية 5. اقتران SLBs مع المواد الكهربائية أو الضوئية يمكن التحقيق في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية الغشاء من خلال استخدام التقنيات التحليلية المختلفة. مضان المجهري 6، 7 الكيمياء الكهربائية، التحليل الطيفي الضوئي 8، 9 المجهر التحقيق، مأكل سطح الرنين 10، وقياس الطيف الكتلي 11 كلها قد استخدمت لدراسة بنية وخصائص SLBs.
صفائف SLB تقدم براعة إضافية في تصميم أجهزة استشعار لفحوصات متعددة 12،13. تطبيقات أخرى استخدام صفائف SLB لتقليد مفترق التي تشكل بين الخلايا المناعية 14. وقد اختلفت أساليب إعداد للصفائف SLB من microfluنهج idic 15 إلى تلك التي توظف الحواجز المادية بين بقع SLB المجاورة. استخدمت 16 مجموعات أخرى أساليب الطباعة 17، الزخرفة الضوئية 18 ومختلف النهج nanoengineering 19 إلى إنشاء صفائف SLB.
في هذه الورقة والفيديو المرفقة ونحن لشرح طريقة لتشكيل المصفوفات SLB عن طريق إيداع SLB المغلفة شافي 2 حبات في صفائف أمر من microwells 20. نشير إلى SLB المغلفة شافي 2 حبات كروية طبقات ثنائية الدهون كما دعمت (SSLBs). هذه التقنية هو امتداد لعمل سابق أن خلق صفائف الحويصلات فوسفورية وbiomembranes المستمدة من مصادر طبيعية 21، التي تبين لنا أيضا نتائج سبيل المثال. وقد اعتمدت أساليب أخرى لarraying جزيئات غشاء حيوي أو حويصلات على أنماط بروابط استهداف محددة على الأسطح التي اقترانه بروابط التكميلية الواردة على سطح الحويصلة. وتشمل الأمثلة البيوتين-جمعية أفيدين 22،23 ومخططات تهجين الحمض النووي 24. نهجنا يتطلب سوى مجموعة microwell مع أي استهداف أو الاعتراف الأنصاف اللازمة. ويعرف حجم SSLBs من قبل قطر تدعم حبة شافي 2، والتي تعاني من انخفاض بولي التبعثر. عن طريق ضبط قطر microwell للتو أكبر من قطر SSLB، سوى SSLB واحدة يستقر في كل microwell. A بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) ممسحة ثم يزيل من على سطح الأرض كل SSLBs التي لا يجمد في microwells. وmicrowells والمصفوفات SSLB الناتجة لديها كثافة عالية (~ 10 5 SSLBs / مم 2) مع 3 ميكرون مركز إلى مركز تباعد وتيرة سداسية. عن طريق إيداع متسلسل SSLBs مع التراكيب الدهون مختلفة، فمن الممكن لإنشاء صفائف متعدد المكونات مع SSLBs وضعه بشكل عشوائي. للتدليل على قدرة الاستشعار صفائف SSLB، استخدمنا تفاعل بكتيريا الكوليرا (CTX) مع غانغليوزيد (GM1) دمجها في SSLBs. معجزيئات الغشاء الطبيعي، تمكنا من الكشف عن نسبة الدهون في خلايا محددة في المصفوفات المتعددة المكونات التي تحتوي على مادة غشاء من اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل وتبين لنا أن monodisperse شافي 2 حبات المغلفة مع طبقات ثنائية الدهون يؤيد يمكن المحتشدة في صفائف microwell دون الحاجة لاستهداف بروابط على طبقات ثنائية الدهون أو سطح الركيزة، وصفائف يمكن استخدامها لوصف التفاعلات السمية الدهون. ونحن ثابت التفكك المحسوبة لCTx/GM1 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى SHO من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM092993)، ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF جائزة التوظيف وDBI 0964216)، ومكتب البحوث البحرية (شركة أوريكس) برنامج الباحث الشاب وجائزة مينيسوتا الشراكة للتكنولوجيا الحيوية وعلم الجينوم الطبية. تم إجراء تصنيع الجهاز في جامعة مينيسوتا مركز Nanofabrication (NFC)، التي تتلقى دعما من جبهة الخلاص الوطني من خلال شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة أيضا إلى MR من المعاهد الوطنية لل، الجمعية الوطنية التصلب المتعدد (CA1060A11)، وأبلباوم، هيلتون، وبيترسون سانفورد المؤسسات الصحية (NS048357، R21 NS073684) والأسرة McNeilus. الكتاب أود أن أشكر Hyungsoon ايم للحصول على المساعدة مع الرسوم التوضيحية وShailabh كومار للحصول على المساعدة مع المجهر الإلكتروني.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. 생화학. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. 생화학. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
