Støttede lipid bilayers og naturlige membran partikler er praktiske systemer som kan tilnærme egenskapene til cellemembraner og bli innlemmet i en rekke analytiske strategier. Her viser vi en metode for å forberede mikromatriser sammensatt av støttede lipid dobbeltlag-belagt SiO 2 perler, fosfolipid blemmer eller naturlige membran partikler.
Lipide dobbeltlagsmembraner danne plasmamembranen av celler, og definerer grensene for subcellulære organeller. I naturen er disse membraner er heterogene blandinger av mange typer av lipider, inneholde membranbundne proteiner og er dekorert med karbohydrater. I noen eksperimenter, er det ønskelig å kople de biofysiske og biokjemiske egenskaper til lipid-dobbeltlag fra de av naturlig membran. Slike tilfeller krever bruk av modellsystemer slik som store vesikler, liposomer eller støttet lipid dobbeltlag (SLBs). Matriser av SLBs er spesielt attraktive for sensing applikasjoner og hermet celle-celle interaksjoner. Her beskriver vi en ny metode for å danne SLB arrays. Submicron diameter SiO 2 perler er først belagt med lipid bilayers å danne sfæriske SLBs (SSLBs). Perlene ble deretter satt inn på en matrise av mikro-fabrikerte submikron-diameter mikrobrønner. Fremstillingen teknikken bruker en "nal" for å rense substratoverflaten, mens leaving bak SSLBs som har slått seg ned i mikrobrønner. Denne metoden krever ingen kjemisk endring av mikro underlaget, og heller ikke noen spesielle rettet ligander på SSLB. Mikro er opptatt av enkelt perler fordi brønnen diameter er innstilt til å være akkurat større enn diameteren perle. Vanligvis er mer 75% av brønnene er opptatt, mens resten forblir tom. I buffer SSLB matriser viser langsiktig stabilitet på mer enn en uke. Flere typer av SSLBs kan plasseres i en enkelt rekke ved serie avsetning, og de matriser kan benyttes for avføling, som demonstrerer vi ved å karakterisere interaksjonen mellom koleratoksin med gangliosid GM1. Vi viser også at fosfolipid-vesikler uten bead støtter og biomembraner fra cellulære kilder kan være sammenstilt med den samme metode og celle-spesifikke membranlipider kan identifiseres.
Lipid-dobbeltlag-membraner er viktige strukturer i naturen. Cellular plasmamembraner og organelle membraner er sammensatt av lipid dobbeltlag som inneholder en rekke molekyler som er nødvendig for liv. Mange livsnødvendige prosesser forekommer på overflaten av celler eller mediert av molekyler assosiert med lipid-dobbeltlag-membraner. Faktisk er mange legemidler mål-prosesser eller molekyler funnet på eller i membraner 1,2. Det er derfor nødvendig å analytisk undersøke prosesser, for eksempel kjemiske reaksjoner eller kovalente bindende hendelser som oppstår på membran flater. Fordi naturlige membraner kan være vanskelig å isolere og / eller grensesnitt med sensorer, benytter mange forskere forenklet modell membraner for å utføre analytiske studier. En rekke modellmembransystemer er beskrevet i litteraturen, som strekker seg fra store vesikler som kan være flere titalls til flere hundre mikron i diameter til liposomer med nanoskala dimensjoner 3,4. Alternatively, planar lipid bilayers avsatt på fast underlag, dvs. støttet lipid dobbeltlag (SLBs), kan være dannet på en rekke ulike overflater, og har vært mye brukt i biofysiske, biokjemiske og analytiske applikasjoner fem. Kopling SLBs med elektriske eller optiske materialer muliggjør undersøkelse av membran biokjemi og biofysikken ved bruk av forskjellige analytiske teknikker. Fluorescens mikroskopi 6, elektrokjemi 7, optisk spektroskopi 8, scanning probe mikros 9, overflate plasmonresonans 10, og massespektrometri 11 har alle blitt ansatt for å studere struktur og egenskaper av SLBs.
SLB arrays gir ekstra allsidighet i utformingen av sensorer for multiplex analyser 12,13. Andre programmer bruker SLB arrays for å etterligne krysset som utgjør mellom immunceller 14. Tilberedningsmetoder for SLB arrays har variert fra microfluidic nærmer 15 til de som benytter fysiske barrierer mellom tilstøtende SLB patcher. 16 Andre grupper har brukt trykkmetoder 17, fotokjemisk mønster 18 og ulike nanoengineering nærmer 19 å opprette SLB arrays.
I denne utredningen og medfølgende video viser vi en metode for forming SLB arrays ved å deponere SLB-belagte SiO 2 perler inn bestilte matriser av mikro 20. Vi viser til SLB-belagte SiO 2 perler som sfæriske støttede lipid dobbeltlag (SSLBs). Denne teknikken er en forlengelse av tidligere arbeid som er laget matriser av fosfolipid-vesikler og biomembraner avledet fra naturlige kilder 21, hvorfra vi viser også eksempelresultater. Andre metoder for arraying biomembrane partikler eller blemmer har stolt på mønstre av spesifikke målgruppe ligander på overflater som assosierer med utfyllende ligander som finnes på vesikkel overflaten. Eksempler inkluderer biotin-avidin foreningen 22,23 og DNA hybridisering ordninger 24. Vår tilnærming krever bare et mikromatrise uten målretting eller anerkjennelse moieties nødvendige. Størrelsen på SSLBs defineres av diameteren av SiO 세스 kulestøttene, som har lav poly-dispersitet. Ved å justere diameteren mikro å bare større enn diameteren SSLB, legger seg bare en enkelt SSLB inn i hver mikrobrønn. Et poly (dimetylsiloksan) (PDMS) nalen deretter fjernes fra overflaten alle SSLBs som ikke er immobilisert i mikrobrønner. De mikrobrønner og resulterende SSLB matriser har høy tetthet (~ 10 5 SSLBs / mm 2) med 3 mikrometer senter-til senteravstanden, og heksagonale periodisitet. Ved serie deponering SSLBs med forskjellig lipid sammensetning, er det mulig å lage flerkomponent matriser med tilfeldig plasserte SSLBs. For å demonstrere sensing evnen til SSLB arrays, brukte vi et samspill av kolera toksin (CTx) med en ganglioside (GM1) innarbeidet i SSLBs. Mednaturlige membran-partikler var vi i stand til å oppdage cellespesifikke lipider i multikomponent matriser inneholdende membranmaterialet fra to forskjellige celletyper.
I dette arbeidet viser vi at monodisperse SiO 세스 kuler belagt med støttede lipid dobbeltlag kan være sammenstilt i mikro arrays uten behov for målretting ligander på lipid-dobbeltlag, eller substratets overflate, og de matriser kan anvendes for å karakterisere toksin-lipid interaksjonene. Den dissosiasjonskonstant beregnet vi for CTx/GM1 binding sammenligner gunstig, gitt stor spredning av verdiene i litteraturen, med en tidligere rapport av Winter et al. Hvor kolloidal sammenstilling av l…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til SHO fra National Institutes of Health (R01 GM092993), National Science Foundation (NSF KARRIERE Award og DBI 0.964.216), Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Program og Minnesota Partnership Award for bioteknologi og Medisinsk Genomics. Device fabrikasjon ble utført ved University of Minnesota Nanofabrication Center (NFC), som mottar støtte fra NSF gjennom National Nanoteknologi Infrastructure Network. Dette arbeidet ble også støttet med tilskudd til MR fra National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), den Applebaum, Hilton, Peterson og Sanford Foundations og MCNEILUS familien. Forfatterne ønsker å takke Hyungsoon Im for å få hjelp med illustrasjoner og Shailabh Kumar for hjelp med scanning elektronmikroskopi.
4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |