Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

Published: August 16, 2014 doi: 10.3791/51517
Automatic Translation
1, 1
1Biomedical Engineering, Wayne State University

Introduction

אחד האתגרים המתמשכים בהנדסת רקמות עצבית הוא יצירת צינור עצבי (NC) המחקה את המטריצה ​​סלולרית נוספת, שבו עצבים לגדול באופן טבעי. מחקרים הראו כי תאים מגיבים למספר גורמים בסביבה שלהם, כולל מכאני, טופוגרפי, דבק ואותות כימיים 1-3. אחד האתגרים העיקריים בתחום זה הוא קביעת השילוב המתאים של אותות ובודת מערכת שיכול לשמור על רמזים לתקופה ממושכת כדי לתמוך בצמיחת תא 4. נוירונים היקפיים ידועים מעדיפים מצע רך, יופנה על ידי סיבים מיושרים, ומגיב לגורם גדילה העצבית (NGF) 5-7. NCS שיכול לספק רמזים כימיים לשבועות הוכח לספק התאוששות תפקודית משופרת קרוב יותר לזה של allografts, תקן הזהב הנוכחי לתיקון עצב 8,9.

שונות חומרים ושיטות ייצור יכול לשמש לייצור מכאני וטופוגרפיאל מקלות 10-13. רמזים מכאניים הם גלום בחומר שנבחר, מה שהופך את הבחירה של החומר המתאים ליישום הקריטי 1,13. שיטות ייצור כדי לשלוט רמזים טופוגרפיים כוללים הפרדה פאזות, הרכבה עצמית וelectrospinning 1,13. גם עבור יישומי microscale, מיקרופלואידיקה, photopatterning, תחריט, מדיח מלח, או קצף גז יכול לשמש 14-17. Electrospinning התפתח כדרך הפופולרית ביותר למהנדס מצעים סיביים לתרבית רקמה בשל גמישות וקלות הייצור 13,18-23. nanofibers electrospun מיוצר על ידי יישום מתח גבוה לפתרון פולימר גורם לו להדוף את עצמו ולמתוח על פני פער קצר לפרוק 24. פיגום מיושר ניתן ליצור על ידי איסוף הסיבים על mandrel מסתובבת מקורקע ופיגומים הבלתי מזדהים נאספים על צלחת נייחת 25. איתות הידבקות יכולה להיות מושגת על ידי ציפוי שנינות פיגום הסיבייםפיברונקטין h או להטות פפטיד הידבקות, כגון RGD, לHA לפני electrospinning 26.

אותות כימיים, כגון גורמי גדילה, הם הכי קשים לשמור לאורך תקופות ממושכות, כי הם זקוקים למקור לשחרור מבוקר. מערכות רבות כבר ניסינו להוסיף שחרור מבוקר לרשתות סיבי electrospun עם רמות שונות של הצלחה. שיטות אלה כוללות electrospinning תערובת, electrospinning תחליב, electrospinning פגז הליבה והצמיד חלבון 27. בנוסף, electrospinning נעשה באופן מסורתי בממס נדיף, אשר יכול לפגוע בכדאיות של החלבון 28, לכן שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבון יש לקחת בחשבון.

גישה זו מציינת במפורש בשילוב אותות מכאניים, טופוגרפיים, כימי ודבק כדי ליצור פיגום מתכונן לצמיחת עצבים היקפית. מכניקת פיגום נשלטת דווקא על ידי סינתזהmethacrylated חומצה היאלורונית (HA). אתרי methacrylation משמשים לצרף crosslinkers תגובתי תמונה. חומר crosslinked הוא כבר לא מסיסים במים ומתפרק באופן בלעדי על ידי אנזימים 29. הסכום של crosslinking משנה את קצב הפירוק, מכניקה ומאפיינים פיזיים אחרים של החומר. באמצעות HA עם 30 methacrylation%, שבו יש מודול מתיחה של ~ 500 אבא, יוצר מצע רך שקרוב למכניקת הילידים של רקמה עצבית, והוא העדיף בדרך כלל על ידי נוירונים 26,29. Electrospinning על mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים לאות טופוגרפית. באמצעות electrospinning יחד עם microspheres מספק אותות כימיים בתוך הפיגום לאורך תקופות ממושכות. כדי לתמוך בmicrospheres צמיחת neurite מכיל NGF המשמשים ליצירת האות הכימית. שלא כמו רוב חומרי electrospun HA הוא מסיס במים ולכן NGF אינו נתקל ממסים קשים במהלך ייצור. כדי להוסיף אות דבק, SCAffold מצופה פיברונקטין. המערכת הושלמה מכילה את כל ארבעת סוגים של אותות שתוארו לעיל: סיבים רכים (מכאניים) מיושרים (טופוגרפיים) עם NGF שחרור microspheres (כימי) מצופה בפיברונקטין (דבק). ייצור ובדיקה של מערכת זו מתוארת בפרוטוקול זה.

התהליך מתחיל בייצור של microspheres עם זוגי אמולסיה מים-ב- שמן מים. התחליב הוא התייצב עם חומרים פעילי שטח, פוליוויניל אלכוהול (PVA). שלב המים הפנימי מכיל את החלבון. כפי שהוא הוסיף לשלב שמן, המכילים את חומר מעטפת PLGA מומס בdichloromethane (DCM), פעילי השטח יוצר מחסום בין שלבי הגנה על החלבון מDCM. אמולסיה זו היא יותר מאשר מפוזרת בשלב מים אחר המכיל PVA כדי ליצור את המשטח החיצוני של microspheres. התחליב היציב הוא עורר לאפשר DCM להתאדות. לאחר השטיפה וlyophilizing אתה נשאר עם המשך microspheres היבשaining החלבון.

לאחר microspheres הושלם הם מוכנים להיות electrospun לפיגומים. ראשית, עליך להכין את פתרון electrospinning. הצמיגות של הפתרון היא קריטית להיווצרות סיבים נכונה. פתרונות של HA הטהור אינם עומדים בדרישה זו; PEO נוסף כפולימר מנשא כדי לאפשר electrospinning. Microspheres מתווספים לפתרון וelectrospun וכתוצאה מפיגום סיבי עם microspheres מופץ ברחבי.

ברגע שהייצור הוא מלא, החלבון צריך להיבדק כדי לוודא את כדאיותה. כדי לעשות זאת, ניתן להשתמש בו תא ראשוני המגיב לNGF. פרוטוקול זה משתמש הגבי שורש הגרעינים (DRG) מעוברי עופות ישנים 8-10 יום. חבילות התא הם זורעים על גבי פיגומים המכילים microspheres מלא NGF או אלה כי הם ריקים. אם NGF הוא עדיין בת קיימא אתה צריך לראות צמיחת neurite משופרת על הפיגומים המכילים NGF. אם NGF הוא כבר לא בת קיימא זה יהיהלא לקדם neurites להרחיב ואמורה להופיע דומה לשליטה.

ההליך המדויק שתואר במסמך זה מתמקד בתמיכה עצבית, לעומת זאת, עם שינויים פשוטים לחומר, שיטת electrospinning, וחלבוני המערכת יכולה להיות מותאמת לסוגים שונים של תאים ורקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 מים / שמן / מים זוגי אמולסיה Microsphere ייצור

  1. ראשית להכין 2% ו0.5% w / v פתרונות של אלכוהול פוליוויניל (PVA) במים ללא יונים. מערבבים את הפתרונות על 50 מעלות צלזיוס עד ברור, זה עלול לקחת כמה שעות. הכן פתרון של 2% v / v איזופרופיל אלכוהול במים ללא יונים.
  2. הכן תמיסה מימית של חלבון הידרופילי רצוי. הטבלה שלהלן מספקת ניסוחים ירושלים.

טבלת 1
טבלת 1:. פתרונות חלבון דוגמא פתרונות החלבון הבאים כבר במארז בהצלחה וelectrospun שימוש בפרוטוקול זה. ניתן להשתמש בפתרוני חלבון הידרופילי אחרים לפי צורך.

  1. הנח 40 מ"ל של פתרון PVA 0.5% לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל ומניח בצד.
  2. בצינור צנטריפוגות 15 מ"ל לפזר 300 מ"ג של 65:35פולי (חומצה לקטית גליקולית שיתוף) (PLGA) ב 3 מ"ל של dichloromethane. מיקסר מערבולת ניתן להשתמש כדי להאיץ את פירוק PLGA.
  3. לשלב 200 μl של פתרון חלבון ו4 μl של 2% פתרון PVA. יוצקים את תערובת החלבונים לתוך תמיסת PLGA (צעד 1.4). הפתרונות יישארו בעיקר נפרדים.
  4. מניחים את הצינור לתוך כוס של מי קרח. באמצעות sonicator שרביט ב ~ 10 ווטס (RMS), להתסיס את הפתרון לכמה שניות (5-10) ועד תחליב לבן וקרם אחיד נוצר.
  5. יוצקים את התחליב לתוך צינור 50 מ"ל מכיל 0.5% PVA (שלב 1.3). מערבבים את הפתרון במהירות גבוהה במיקסר מערבולת ~ 20 שניות. הפתרון יהיה לפתח עכירות.
  6. העבר את התחליב לכוס 200 מ"ל ומניחים על צלחת ומערבבים ב350 סל"ד למשך 2 דקות. הוסף 50 מ"ל של 2% באלכוהול רפואי לכוס בצלחת ומערבבים. אפשר התערובת להמשיך ערבוב מינימאלי של שעה 1 כדי לאפשר DCM להתאדות וPLGA להקשיח.
  7. ההעברה tהוא microsphere פתרון לתוך צינורות צנטריפוגה.
  8. צנטריפוגה ב425 XG במשך 3 דקות. Microspheres יאסוף בחלק התחתון של הצינור ומופיע לבן. מוציא בזהירות את supernatant מהצינור, מעל microspheres, ולאחסן בבקבוק 500 מ"ל.
  9. יש לשטוף את microspheres עם מים ללא יונים על ידי מילוי הצינור שלושה רבעים מלאים וטלטלת אותה כדי להפיץ את microspheres בנוזל.
  10. חזור על שלבים 1.10 & 1.11 ארבעה פעמים.
  11. בעקבות השטיפה הסופית, להסיר את supernatant שוב ומניחים בבקבוק 500 מ"ל עם דוגמאות האחרות. להקפיא את microspheres שנאסף בצינור צנטריפוגות, אז Lyophilize לפחות 24 שעות.
  12. דמיין את microspheres תחת מיקרוסקופ אור או עם מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. Microspheres לא גדול יותר 60 מיקרומטר הוא לelectrospinning היעיל. אם microspheres הם גדול מדי, פעמים sonicating או vortexing יותר עשויות להידרש בשלב 1.6 או 1.7.
    13. <li> חנות microspheres המיובש במקפיא -20 ° C.
  13. אופציונאלי: השתמש assay חלבון, לפי הוראות יצרן, כדי לבדוק את כמות החלבון בבקבוק 500 מ"ל מצעד 1.10 30. זה משמש לחישוב אחוזים של חלבון במארז בmicrospheres, על ידי הפחתת הכמות בפתרון ממה שהיה בשימוש בתהליך הייצור.

הערה: כדי להמחיש את מיקום החלבון בmicrosphere להוסיף Rhodamine 2 מיקרוגרם / מ"ל לפתרון PLGA 31 ובלתמצת חלבון מצומדות FITC איור 1 מציג דוגמא..

.2 Electrospinning עם מיקרוסכמות

  1. לפני הכנת פתרון electrospinning, ליצור פתרון 0.5% w / v של photoinitiator, במים ללא יונים על ידי ההמסה על 37 מעלות צלזיוס. תהליך זה יכול להימשך מספר שעות.
  2. צור 2% w / v methacrylated חומצה היאלורונית (מהא) (ראה Burdick et al. לסינתזה) 29, 3%w / v 900 פולי KD (אתילן אוקסיד) (PEO) ו0.05% w / פתרון יוזם התמונה v במים ללא יונים.
    1. לחשב את הכמות הנכונה של מהא וPEO לעצמה הרצויה. לדוגמא, 10 מ"ל של electrospinning פתרון דורש 200 מ"ג של מהא ו300 מ"ג של PEO.
    2. ממיסים את PEO במים ללא יונים ב90% מהנפח הסופי הרצוי (9 מ"ל לדוגמא זו). זה עלול לקחת כמה שעות, צלחת מחוממת ומערבבים או אמבט מים ב 37 C ° ניתן להשתמש כדי להאיץ את התהליך.
    3. הבא להוסיף מהא ולהשתמש במיקסר מערבולת לעורר הפתרון עד בהיר. זה ייקח רק כמה דקות.
    4. לבסוף להוסיף את פתרון יוזם תמונה 0.5% למלא את שאר 10% הנפח (מ"ל 1 לדוגמא זו).
  3. הוספת microspheres בריכוז הרצוי עד 400 מ"ג / מ"ל. מערבבים את הפתרון על מיקסר מערבולת עד microspheres מפוזר באופן שווה בפתרון.
  4. מעבירים את הפתרון למזרק ולצרף bl 18 מד 6 אינץמחט קצה UNT.
  5. הנח את המזרק במשאבת מזרק ולהגדיר אותו לוותר ב1.2 מ"ל / שעה.
  6. קלטת שכבה של נייר אלומיניום על צלחת האוסף או mandrel. זה מאפשר לעד קל נקי ואחסון של הפיגום המוגמר. Mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים. צלחת שטוחה או mandrel הנייח תגרום לסיבים מסודרים באופן אקראי.
  7. חבר את חוט הקרקע מכוח מקור מתח גבוה למנגנון הגבייה. חבר את התקע החיובי למחט.
  8. התאם את פני השטח משאבת מזרק וגבייה, כך שיש 15 סנטימטר בין קצה המחט ומשטח אוסף.
  9. התחל שאיבת הפולימר, כאשר הפתרון נראה לעין בסוף המזרק, להפעיל את מקור המתח ולהגדיר את המתח ל24 ק זהירות:. ברגע שהמתח מופעל לא לגעת בשום חלק מתכתי של המערכת. תשלום יכול גם לקפוץ למרחקים קצרים מחלקים חשמליים לעור.
  10. הפעל את הפתרון עד דעובי פיגום esired מושגת. כשיושלם לכבות מקור מתח ומשאבת מזרק.
  11. הסר רדיד עם פיגום מצורף. פיגומים שהושלמו מכילים חלבון מאוחסנים ב-20 ° C מקפיא.

.3 חלבון את הפעילות הביולוגית של הבדיקה

  1. הכן תקשורת תרבית תאים. הוסף 10% v / v בסרום שור עוברי, 1% L-גלוטמין / v v, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין V / V לבינוני של הנשר השתנה Dulbecco.
  2. coverslips זכוכית בחר שמתאים לחלוטין לצלחת גם.
  3. השתמש 3 methacrylate propyl (Trimethoxysilyl) לטיפול בcoverslips כפי שתואר על ידי היצרן. Methacrylation משפר דבקות פיגום לcoverslips.
  4. צרף coverslips methacrylated לאזור האוסף של electrospinner עם קלטת דו צדדית נשלפת לפני electrospinning. ספינינג על coverslips מקל טיפול וצפייה.
  5. Electrospin לעובי רצוי כפי שתואר לעיל.
  6. חרה electrospinning להסיר בזהירות coverslips מmandrel. מניחים את הפיגום coverslips המצופה לתוך תא חנקן ברור ולהבטיח כי כל החמצן מטוהר.
  7. מניחים את החדר והפיגום תחת 2 ננומטר 365 אור 10 mW / cm במשך 15 דקות. לאחר crosslinking מקום לצלחת גם בגודל המתאים. ודא שצד הפיגום פונה כלפי מעלה.
  8. פיגומי מקום מתחת לפנס קוטל חיידקים ל30 דקות לעקר. אם פיברונקטין הרצוי או חלבון אחר משמש כציפוי כדי לשפר את הידבקות תא. עקוב אחר ההוראות של היצרן לפיגומי מעיל.
  9. קציר הגבי שורש הגרעינים (DRG) כפי שתוארו בעבר על ידי הולנבק 32. DRG אחד יהיה צורך לכל coverslip פיגום מכוסה נבדק.
  10. הנח 100-200 μl של תקשורת על כל פיגום בצלחת גם. בזהירות להניח DRG אחד על כל פיגום בטיפת התקשורת. לפיגום עבה ייתכן שתהיה צורך יותר בתקשורת; DRG צריך להיות שקוע באופן מלא ולא floaטינג.
  11. דגירה הפיגום וDRG על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר לתא לדבוק בפיגום.
  12. מלא את התקשורת לרמה המתאימה להיטב ומניח בחזרה לתוך החממה. המשך דוגרים במשך 4-6 ימים.
  13. לאחר תקופת הדגירה להסיר בזהירות את התקשורת מכל טוב ולשטוף בעדינות פעם עם PBS. תקן תאים ל30 דקות באמצעות 4% w / paraformaldehyde v.
  14. תאי כתם באמצעות כתם נוגדן לneurofilament. זה יאפשר הדמיה של התוצאה neurite לכימות. גם DAPI יכול לשמש לצפייה בגרעינים של התאים. פרוטוקול דוגמא מכתים תואר על ידי Sundararaghavan ועמיתים 14.
  15. דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    1. מניחים צלחת גם על הבמה של מיקרוסקופ.
    2. אתר את מסת התאים באמצעות הגדרות מסננת ועירור לDAPI.
    3. ברגע שהתא הוא לעבור את המסנן לFITC לדמיין neurites המורחבת. Uלשיר פונקצית התפר במיקרוסקופ לאסוף ולשלב תמונות רבות ככל נחוץ כדי לראות את המבנה כולו. חזור על פעולה עבור DAPI, FITC ושדה בהיר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Microspheres 50 ± 14 מיקרומטר בקוטר עם אנקפסולציה חלבון מעל 85% הופקו באופן עקבי וelectrospun לפיגומים. גודל נקבע על ידי הדמיה דגימות של microspheres משלוש מנות ייצור נפרדות. התמונות שבו נתפסו על מיקרוסקופ אופטי ואורכים שבו נמדד באמצעות תוכנת מעבדה מסחרית. איור 1 מציגה היסטוגרמה של התפלגות הגודל. שיעור Encapsulation נבדק גם משלוש מנות microsphere נפרדות, על ידי כימותי החלבון שנמלט במהלך תהליך הייצור.

איור 2 מראה microspheres נציג עם Rhodamine (2 מיקרוגרם / מ"ל) ב-FITC אלבומין בסרום פגז ושור PLGA (BSA) כמוס בתוך. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפגז ניתן לראות בבירור (אדום) עם החלבון מרוכז על הפנים (הירוק).

כדי להעריך אנקפסולציה, microsphereים היה מלא בBSA ונבדק לשחרור חלבון עם assay חלבון ברדפורד. PLGA מתפרק על ידי הידרוליזה של אג"ח אסתר, יצירת פערים גדולים יותר לבריחה חלבון. Microspheres להמשיך שחרור במשך 60 ימים (איור 3). השחרור מתחיל בפרץ ראשוני ולאחר מכן ממשיך כmicrospheres לשבור.

לאחר electrospinning microspheres ניתן לראות בכל רחבי המבנה הסיבי 3D. איור 4 מראה תמונת SEM של הפיגום השלם שבו ניתן לראות תחומים במספר שכבות (המסומן בחצים). הפצה של microspheres בפיגומים נמדדה להיות 15.3 ± 3.6 תחומים / 2 מ"מ. הפיגום מחזיק microspheres במקום מניעת הגירה ממקום היעד. כmicrospheres לשבור הם משחררים NGF לתוך הפיגום לעודד 33,34 צמיחת neurite. זה יוצר משלוח מתמשך של חלבון לאורך כל הפיגום כדי לתמוך בצמיחה של תאים ותאים לעודד לחדור לפיגום.

לבסוף, הגבי שורש הגרעינים (DRG) שמשו כדי לבדוק את הכדאיות של NGF בmicrospheres, בתוך הפיגום. איור 5 מראה DRG זורעים על פיגום המכיל microspheres עמוס NGF ליד אחת microspheres המכיל ללא חלבון בהם. יש הרחבות יותר neurite גלויים המשתרעות מDRG על פיגום NGF, המצביעות על כך NGF נשאר קיימא ועידוד צמיחה.

איור 1
איור 1 התפלגות גודל Microsphere. מיקרוסכמות מיוצרת על ידי פרוטוקול זה הם 50 ± 14 מיקרומטר בקוטר. הגרף מראה היסטוגרמה של קוטר microsphere ב5 מיקרומטר פחים.

2highres.jpg "/>
איור 2 תמונה של פלורסנט מיקרוסכמות. 2 מיקרוגרם / מ"ל Rhodamine נכללה בפתרון PLGA לדמיין את קליפת microsphere (אדום) וBSA-FITC נעטף לדמיין את החלבון (ירוק). חלבון באופן ברור ניתן לראות בתוך המעגל. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3 חלבון שחרור עקום. שחרור BSA מmicrospheres מעל 60 ימים נמדדו באמצעות assay חלבון ברדפורד. הפרץ הראשוני הוא כנראה עקב BSA שצורף למשטח החיצוני. כPLGA מתפרק, החלבון משתחרר לאורך זמן.

/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
איור 4 פיגום המכיל מיקרוסכמות. תהליך electrospinning מאפשר microspheres להיות משולב בכל העומק של הפיגום. חצים () מציינים את המיקום של microspheres. בר = 500 תמונה מיקרומטר. הגדלה גבוהה (B) בקנה מידה של microsphere אחד עם nanofibers מהפיגום מעליו. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
.5 תאים ראשוניים איור NGF את הפעילות הביולוגית של מבחן. הגבי שורש הגרעינים נבצרו מביצי אפרוח בן 8 ימים וזורעים על פיגומים עם microspheres מולא NGF (א) או microspheres הריק (B). DRGsהיו מוכתמים בנוגדן neurofilament, נוגדנים משני FITC וDAPI לדמיין את גרעין התא. תמונות מראות מוגברות תולדת neurite בנוכחות microspheres NGF הטעון כפי שצוינה על ידי neurites FITC הצבעונית (ירוקה). זה מראה שפורסם NGF הוא בת קיימא ויכול לקדם את הצמיחה. תמונות צולמו עם מיקרוסקופ confocal. סרגל = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקרים רבים הראו שיכולים להיות מופנה תאי עצב על ידי רמזים טופוגרפיים (יישור סיבים) ואותות כימיים (גורמי גדילה) 1,2,10,11,35. Electrospinning הוא שיטה קלילה כדי ליצור סיבים מיושרים. גורמי גדילה לעודד צמיחת עצב אלא כדי לכלול אותם לתוך תעלות עצבים (NC), נדרשת שיטה לשחרור מושהה. כדי ליצור מערכת חזקה יותר עם שני הרמזים, צריכים להיות משולבים שני האותות הללו. מספר שיטות נחקרו בעבר על מנת לספק שחרור ממושך של חלבון בתוך הפיגום הסיבי electrospun להתחדשות של עצבים אבל אף אחד עד היום היה מסוגל לשחרר מתמשך במשך 60 ימים. בנוסף, הדפוסים של שחרור גורם גדילה לא היו אפשריים. במסמך זה אנו מתארים מערכת לשלב electrospinning עם משלוח microsphere PLGA לספק שני האותות.

שיטות מסורתיות ללפברק microspheres PLGA, כגון הפרוטוקול שתואר על ידי דה בור et al. </ Em>, המיוצר על microspheres הרבה יותר גדול 33 (300 ± 100 מיקרומטר) שלא יכל לעמוד בתהליך electrospinning. מספר ניסיונות לשלב אותם בפיגומים לא צלחו. זה הוביל לשימוש בsonicator, במקומו של מיקסר המערבולת, לפיזור טוב יותר התחליב הראשון וליצור כדורים קטנים יותר. ברגע שmicrospheres היה קטן מספיק, הם עברו בקלות דרך המחט וelectrospun יחד עם שאר הפתרון. פתרון electrospinning העיקרי בפרוטוקול זה הוא מומס במים, ולא ממס קשה, כדי למנוע נזק לNGF ולספק מצע נוח לתא צמיחה 28.

שיטות רבות נבדקו על מתן אותות טופוגרפיים וכימיים לאתרי פגיעה עצביים. חלק מהניסיונות הראשונים בבית מספק NGF לפציעות מעורב לשים פתרונות של NGF או microspheres המכיל NGF החופשי למרכז צינור מוצק עצב סיליקון (NC) 36. ים אלהגדילה העצבית upported; עם זאת הם לא מספקים רמזים נוספים או לאפשר את יכולת דפוס המיקום של גורמי הגדילה בNC. בדוגמה האחרונה יותר יאן ואח. [-co (חומצה לקטית) - [(חומצה גליקולית) -alt- (L-ליזין)]] אל פולי משמשים. (PLGL) הותאם על ידי השתלת גלאי-Arg-גלאי-ASP-גלאי (פפטיד RGD) וNGF לפברק תעלות עצבים PLGL-RGD-NGF 37. באופן דומה, אלה סיפקו את האות הכימית שקדמה גדילה עצבית, אך לא ספקו רמזים אחרים. מחקר נוסף המשמש NGF הגלום microspheres עם פיגומי electrospun מעל ומתחתיהם 38. מערכת זו אינה מספקת שני רמזים הטופוגרפיים של פיגום סיבי בשילוב עם NGF כרמז כימי. עם זאת, שחרורו נמשך רק שבוע, וזה לא מספיק זמן כדי לתמוך בתיקון עצב היקפי, ואת מיקומו של microspheres אינו מבוקר היטב.

חוקרים אחרים התמקדו בשילוב האותות הכימיים לתוך הסיבים. פגש אחתהוד יוצר תחליב של החלבון הידרופילי עם פולימר הידרופובי. שיטה זו הייתה מסוגלת לספק רמזים טופוגרפיים וכימיים, אולם 60% מהחלבון שוחרר ב12 הימים הראשונים 39. דוגמא נוספת המשמשת electrospinning קואקסיאליים לתמצת NGF בתוך פולי (P (LLA-CL)) סיבים (חומצה לקטית caprolactone) 40,41. שיטה זו סיפקה תוצאות דומות לחתימה במודל גיד הנשה חולדה. עם זאת, ציוד מיוחד צריכים בשביל electrospinning קואקסיאליים ולא ברור על מה לדרג החלבון שוחרר, ואם זה יכול להיות ממושך. שילוב של רמזים טופוגרפיים בצורה של סיבי electrospun מיושרים ואותות כימיים דרך microspheres שישחרר במשך 2 חודשים כפי שמתואר כאן, מספק רמזי סינרגיסטי מרובים, והוא מתכונן מאוד כדי לספק סביבה מותאמת אישית.

יש כמה בעיות שצריכות להילקח בחשבון כאשר electrospinning; גורמים סביבתיים יכולים להשפיע על electrosמצמיד של כל פתרון. שינוי בלתי צפוי בלחות, למשל, יכול להיות השפעה משמעותית על תוצאות electrospinning ולגרום לסיבים עולים בקנה אחד. העובדה שיש בחדר נפרד שניתן לשלוט בי לסביבה היא מאוד מועילה. טמפרטורה של 70 ° F עם לחות 50% שימשה לניסויים אלה. בעיה פוטנציאלית נוספת עם מערכת electrospinning היא מעגלים קצרים; לעתים קרובות הם יוצרים ניצוצות ברורים בין חלקי המזרק ומתכת על המשאבה. כדי למנוע, פלסטיק במקום זה או מבודד אחר ביניהם; פלסטיק במשקל שקית אחסון מזון עובד טוב. באופן דומה, מטענים חשמליים תועים בסביבה יכולים לגרום לחומר להצטבר במקומות לא צפויים. כדי להימנע מכך אתה יכול ליצור מארז עם גיליונות אקריליק או חומר בידוד אחר. ניתן למצוא מידע נוסף על התאמת תנאי electrospinning בסקירה על ידי 24 סיל.

השלבים הבאים בהליך זה יכללו encapsulating Gro האחרwth גורמים כדי ליצור פיגומים דינמיים יותר המכילים גורמי גדילה מרובים. לדוגמא, NGF הוכח לעבוד בסינרגיה עם גורם גדילה נגזר תא גלייה לתמוך נוירונים חושיים ומוטורי 3. שימוש microspheres PLGA, אנו יכולים לשלוט על קצב השחרור על ידי שינוי L: יחס G, אשר יאפשר לנו לספק גורמי גדילה שונים בקצב שונה. שיפוע של microspheres גם יכול להיות שנוצר כדי לבנות מערכת תמיכה מורכבת יותר שמכוונת את התנהגות תא. בנוסף, גורמי הידבקות יהיו מצומדת לחומר הפיגום ישירות דרך התגובה בנוסף של מיכאל 26. לבסוף, המערכת תיבחן עם in vivo מודל גיד הנשה חולדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Invitrogen D1306
Irgacure 2959 BASF 24650-42-8 Protect from light
PEO 900 kDa Sigma-Aldrich 189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B Polysciences, Inc. 23591-100 Prepare stock solution in DMSO
Syringe Pump KD Scientific KDS100
Power Source Gamma High Voltage ES30P-5W
Motor Triem Electric Motors, Inc 0132022-15 Must attach to a custom built mandrel
Tachometer Network Tool Warehouse ESI-330 Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter EXFO S1000
Needles Fisher Scientific 14-825-16H
Coverslips Fisher Scientific 12-545-81
Polyvinyl Alcohol Sigma-Aldrich P8136-250G
Isoporopyl Alcohol Sigma-Aldrich I9030-500mL
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9703-100
BSA-FITC Sigma-Aldrich 080M7400
β-Nerve Growth Factor (NGF) R&D Systems 1156-NG
65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) Sigma-Aldrich 1001554270
Dichloromethane Sigma-Aldrich 34856-2L
Coomassie (Bradford) Protein Assay Thermo Scientific 1856209
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich 1001558456
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
DMEM Lonza 12-604F
FBS Atlanta Biologicals S11150
PBS Hyclone SH30256.01
Glutamine Fisher Scientific G7513
Pen-Strep Sigma-Aldrich P4333
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
  2. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
  3. Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
  4. Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
  5. Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
  6. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
  7. Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
  8. Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
  9. Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
  10. Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
  11. Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
  12. Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
  13. Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
  14. Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
  15. Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
  16. Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
  17. Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
  18. Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W. Electrospinning technology in tissue regeneration. Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).
  19. Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
  20. Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
  21. Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
  22. Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
  23. Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
  24. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  25. Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
  26. Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
  27. Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
  28. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  29. Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
  30. Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
  31. Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
  32. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
  33. Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
  34. Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
  35. Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
  36. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
  37. Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
  38. Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
  39. Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
  40. Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
  41. Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).

Tags

הנדסת ביוטכנולוגיה גיליון 90 Electrospinning חומצה היאלורונית PLGA מיקרוסכמות בשחרור מבוקר הנדסת רקמות עצבית נדידת תאי בימוי
גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Whitehead, T. J., Sundararaghavan,… More

Whitehead, T. J., Sundararaghavan, H. G. Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds. J. Vis. Exp. (90), e51517, doi:10.3791/51517 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter