Summary

Two-Photon<em> In vivo</em> Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

Published: May 12, 2014
doi:

Summary

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Abstract

Nella corteccia dei mammiferi, i neuroni formano reti estremamente complicate e scambiare informazioni a livello delle sinapsi. I cambiamenti della concentrazione sinaptica, nonché aggiunta / rimozione di sinapsi, si verificano in modo dipendente dall'esperienza, fornendo la base strutturale di plasticità neuronale. Come componenti postsinaptici delle sinapsi più eccitatori nella corteccia, spine dendritiche sono considerati un buon indicatore di sinapsi. Prendendo vantaggi della genetica del topo e tecniche di etichettatura fluorescenti, i singoli neuroni e le loro strutture sinaptiche possono essere etichettati nel cervello intatto. Qui vi presentiamo un protocollo di imaging transcranica con due fotoni microscopia a scansione laser per seguire fluorescente post-sinaptici spine dendritiche nel tempo in vivo. Questo protocollo utilizza un preparato assottigliato-teschio, che mantiene il cranio intatto ed evita effetti infiammatori provocati dall'esposizione delle meningi e la corteccia. Pertanto, le immagini possono essere acquisite subito dopo suviene eseguita rgery. La procedura sperimentale può essere eseguita ripetutamente su vari intervalli temporali da ore ad anni. L'applicazione di questa preparazione può anche essere esteso per indagare diverse regioni corticali e strati, così come altri tipi di cellule, in condizioni fisiologiche e patologiche.

Introduction

La corteccia dei mammiferi partecipa a molte funzioni cerebrali, dalla percezione e il controllo del movimento per l'elaborazione delle informazioni sensoriali astratta e cognizione. Varie funzioni corticali si basano sui diversi circuiti neurali, che sono costituiti da diversi tipi di neuroni che comunicano e scambiano informazioni su singole sinapsi. La struttura e la funzione delle sinapsi sono costantemente in corso di modifica in risposta alle esperienze e patologie. Nel cervello maturo, la plasticità sinaptica assume la forma di entrambe le modifiche di forza e l'aggiunta / rimozione di sinapsi, che giocano un ruolo importante nella formazione e il mantenimento di un circuito neurale funzionale. Spine dendritiche sono le componenti postsinaptici della maggioranza delle sinapsi eccitatorie nel cervello dei mammiferi. Il fatturato costante e le variazioni morfologiche delle spine si crede per servire come un buon indicatore di modifiche nelle connessioni sinaptiche 1-7.

Due fotoni scansione laser microscopia offre penetrazione profonda attraverso fitti, preparati opachi e bassa fototossicità, che lo rende adatto per l'imaging dal vivo nel cervello intatto 8. In combinazione con marcatura fluorescente, imaging a due fotoni fornisce un potente strumento per sbirciare nel cervello vivente e seguire riorganizzazione strutturale a livello delle sinapsi individuali con alta risoluzione temporale e spaziale. Vari metodi sono stati utilizzati per preparare topi per l'imaging dal vivo 9-13. Qui, descriviamo un preparato assottigliato-teschio in vivo di due fotoni imaging per studiare la plasticità strutturale postsinaptici spine dendritiche nella corteccia mouse. Usando questo approccio, i nostri studi recenti hanno rappresentato un quadro dinamico di cambiamenti spine dendritiche in risposta alle abilità motoria imparando Con la crescente disponibilità di animali transgenici con sottoinsiemi di neuroni fluorescente e rapido sviluppo di vivo tecniche in materia di etichettatura, procedure analoghe qui descritti possono essere applicati anche di indaginete altri tipi cellulari e regioni corticali, in combinazione con altre manipolazioni, così come utilizzato in modelli di malattia 16-23.

Protocol

Approvazione deve essere ottenuto da istituti d'origine prima dell'inizio della chirurgia e studio di imaging. Esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti della University of California, Santa Cruz Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa. 1. Chirurgia Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e sterilizzare l'area di lavoro con il 70% di alcol accuratamente prima di un interv…

Representative Results

In YFP-H topi linea 25, proteina fluorescente gialla esprime in un sottoinsieme di neuroni piramidali strato V, che proiettano loro dendriti apicali agli strati superficiali della corteccia. Attraverso la preparazione assottigliato-teschio, i segmenti dendritiche fluorescente possono essere ripetutamente ripreso sotto il microscopio a due fotoni su vari intervalli di imaging, che vanno da ore a mesi. Qui mostriamo un esempio di rappresentazione quattro volte le stesse dendriti oltre 8 giorni in corteccia moto…

Discussion

Per ottenere un successo preparato assottigliato-teschio, diversi passaggi in questo protocollo sono cruciali. 1) Lo spessore del cranio. L'osso cranico ha una struttura a sandwich, con due strati di alta densità dell'osso compatto e uno strato intermedio di bassa densità dell'osso spugnoso. Mentre il micro trapano ad alta velocità è adatto per rimuovere gli strati esterni di osso compatto e osso spugnoso, la lama microchirurgico è ideale per diluire lo strato interno di osso compatto. Poiché lo spesso…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo James Perna per l'illustrazione grafica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Mental Health a YZ

Materials

Ketamine Bioniche Pharma 67457-034-10 Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine Lloyd laboratories 139-236 Mixed with ketamine for anesthesia
Saline Hospira 0409-7983-09 0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades Electron microscopy sciences 72000 Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62 Sterile alcohol prep pads
Eye ointment Henry Schein 102-9470 Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill Fine Science Tools 18000-17 The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs Fine Science Tools 19007-14 1.4 mm diameter
Microsurgical blade Surgistar 6961 The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue Fisher Scientific NC9062131 Fix the head plate onto the skull
Suture Havard Apparatus 510461 Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope Olympus SZ61
CCD camera Infinity
Two-photon microscope Prairie Technologies Ultima IV
10X objective Olympus NA 0.30, air
60X objective Olympus NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP

References

  1. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  2. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
  3. Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
  4. Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
  5. Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
  6. Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
  7. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  9. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
  10. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
  11. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
  12. Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
  13. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
  14. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
  15. Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
  16. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
  17. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
  18. Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
  19. Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
  20. Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
  21. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
  22. Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
  23. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
  24. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  25. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  26. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
  27. Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
  29. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
  30. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
  31. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  32. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
  33. Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).

Play Video

Cite This Article
Yu, X., Zuo, Y. Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (87), e51520, doi:10.3791/51520 (2014).

View Video