Cellodling in vitro modell för Toxic Inhalerat Chemical Testing
Summary
Detta protokoll är utformad för att påvisa exponering metod för cellkulturer till inhalerade giftiga kemikalier. Exponering av differentierad luft-vätska gränssnitt (ALI) kulturer av epitelceller i luftvägarna ger en unik modell av luftvägs exponering för giftiga gaser som klor. I detta manuskript beskriver vi effekten av klor exponering på luft-vätska gränssnitt kulturer av epitelceller och nedsänkt kultur av hjärtmuskelceller. In vitro exponeringssystem tillåter viktiga mekanistiska studier för att utvärdera vägar som sedan skulle kunna användas för att utveckla nya läkemedel.
Abstract
Cellodlingar är oumbärliga för att utveckla och undersöka effektiviteten för terapeutiska medel, före deras användning i djurmodeller. Vi har en unik förmåga att modellera väl differentierade mänsklig luftvägsepitel och hjärtmuskelceller. Detta kan vara ett ovärderligt verktyg för att studera de skadliga effekterna av giftiga inhalerade kemikalier, såsom klor, som normalt kan interagera med cellytorna, och bildar olika biprodukter vid reaktion med vatten, och begränsa deras effekter i nedsänkta kulturer. Vår modell med hjälp av väl differentierade mänskliga luftvägs epitelial cellkulturer vid luft liqiuid gränssnitt kringgår denna begränsning samt ger en möjlighet att utvärdera kritiska mekanismer för toxicitet av potentiella giftiga inhalerade kemikalier. Vi beskriver ökad förlust av membranintegritet, caspase utsläpp och död på giftiga inhalerad kemikalier såsom klor exponering. I den här artikeln föreslår vi metoder för att modellera klor exponering i däggdjur hjärta och luftvägar epitelceller calnar i kultur och enkla tester för att utvärdera dess effekt på dessa celltyper.
Introduction
Exponering för giftiga inhalerade kemikalier (tics) / gaser som klor (Cl 2) är fortfarande ett pågående hälsoproblem i oavsiktliga exponeringar samt deras potentiella användning som ett kemiskt hot agent. Även om lungorna är det primära målet, är organ som hjärta och hjärna påverkas också 1-3. In vivo-modeller används i allmänhet för toxicitetstester från tics, men in vitro-tester för bedömning toxicitet är enklare, snabbare och mer kostnadseffektivt. I vitro-modeller tillåter också för en omfattande utredning av agent-cell interaktioner som kan vara svåra in vivo för att utvärdera. Sådana in vitro-exponering system är sällsynta och dessutom i vissa konventionella modeller där toxiska medel tillsätts till odlingsmediet i vilket cellerna är nedsänkta, kan egenskaperna hos de ombud ändras på grund av växelverkan och bindning till komponenter i mediet. I sådana scenarier cellkultursystem som luft-vätska gränssnitt (ALI) kulturer av primära mänskliga epitelceller i luftvägarna, som föreslås här, som kan vara direkt utsatta för gasformiga ämnen kan vara lovande.
Epitelceller som kantar luftvägarna är de första raderna i försvar mot inhalerade giftiga kemikalier. Den humana luftvägsepitel bildar en fysisk barriär mellan lumen och de underliggande cellerna i lungan och deltar i svaret hos lungan. Den producerar ett antal cytokiner och andra pro-och antiinflammatoriska medel samt utsöndrar slem / luftvägsytan vätska (ASL) som täcker epitelet. En av begränsningarna i konventionell nedsänkt i odlings vitro-system är också att ASL och slem som täcker epitelytan avlägsnas eller spädas. Detta återspeglar inte det fysiologiska tillståndet hos lungepitelceller som utsätts för luft. Därför bör ett ideal i systemet vitro för test TIC toxicitet replikera denna arkitektur. Det finns ett stort intresse för att utveckla snabbscreening metod som förutsäger in vivo toxicitet. Epitelceller odlas vid ALI differentiera och har väl-differentierade strukturer och funktioner i jämförelse med celler som odlats nedsänkta och servera en överlägsen modell av luftvägarna.
I denna studie beskriver vi användningen av luft-vätske-interface kultur av människans luftvägar (tracheobronchial) epitelceller för att testa giftig toxicitet inandad gas och jämföra det med en nedsänkt cellkultur cardiomyocyte, därför studera ett annat viktigt mål för toxiciteten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den vanligaste typen av akuta toxiska exponeringar uppstår när man andas en giftig kemikalie i lungorna. Dessa kemikalier kan också snabbt tas upp i blodet och kan påverka andra organ såsom hjärna och hjärta. Toxiciteten av olika agenter som använder djurmodeller Inandning studeras och rapporteras allmänt, men mekanismerna är mindre väl förstådd. Detta är ett stort hinder i utvecklingen av effektiva behandlingar. Avsaknad av in vitro-exponeringssystem är en primär orsak till bristen på mekanist…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av motverka Program, National Institutes of Health (NIH), Kontor av direktören, och National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Grant Number U54 ES015678 (CWW). SA stöds också av Barnens sjukhus Colorado / Colorado School of Mines Samverkan Pilot Award # G0100394 och Barnsjukhuset Colorado Research Institue Pilot Award # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
