qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

요약

이 프로토콜은 포르말린이 고정된 파라핀 내장 생검 조직에서 거대세포바이러스의 qPCR 검출을 설명하며, 이는 빠르고 민감하며 특이적이며 모호한 헤마톡실린 및 에오신 또는 면역조직화학적 염색 패턴을 해석하는 데 유용합니다.

초록

그것은 심각한 감염을 개발하기 위해 자신의 더 큰 위험 관련, 위장 (GI) 면역 억제 환자의 기관에 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염을 식별하는 데 매우 중요합니다. CMV 감염의 검출을위한 다수의 실험 방법 혈청학, 바이러스 배양, 분자 및 방법을 포함하여 개발되었다. 종종, 이러한 방법은 CMV와 조직의 참여를 반영하고 특히 지역 조직의 참여를 식별하지 않습니다. 따라서 위장관에서 CMV 감염의 검출은 자주 생검 조직의 조직 학적 전통에 의해 이루어집니다. 면역 조직 화학 (IHC)과 함께 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) 염색이 생검 검사의 대들보가 남아있다. H & E와 IHC 때로는 해석이 어려워, 비정형 (모호한) 염색 패턴을 초래한다. 그것은 CMV 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)이 성공적으로 매우 포르말린 - 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 조직에서 수행 될 수 있다는 것을 나타내었다민감도와 특이도가 높은. 이 프로토콜의 목적은 임상 실험실 설정에 FFPE 생검 조직에서 CMV의 검출을위한 qPCR에 테스트를 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 GI 조직 검사에서 CMV에 대한 모호한 염색의 경우 환자에 대한 큰 도움이 될 전망이다.

서론

임상 검체에서 거대 세포 바이러스 (CMV) 감염의 해석은 매우 중요하다. CMV는 헤르페스 바이러스의 betaherpesvirinae 아과의 구성원입니다. 다른 헤르페스 바이러스와 유사하게, CMV 활성 바이러스 복제 ^하나의 부족에 의해 특징 영구 또는 잠복 감염을 확립하는 기능을 갖는다. 바이러스의 재 활성화는 질병의 증상 ^2-4을 동반 할 수 비리 릴리스 특징 활성 바이러스 복제, 선도, 스트레스 또는 다른 면역 억제의 시간 동안 발생할 수 있습니다. 위장 (GI) CMV 질환의 증상은 자주 복통 및 / 또는 혈변 ^1이 (가) ^{있습니다.}

조직 학적으로 거대 세포 바이러스 위장염의 진단은 헤 마톡 실린 및 CMV 바이러스 흠을 식별 할 수 에오신 (H & E)를 사용합니다. 임상 혐의가 높은 아직 명백한 흠이 발생하지 않습니다되는 경우, 면역 조직 화학 (IHC)는 자주 외래 시험 방법으로 사용됩니다. 그러나, IHC또한 해석이 어려운 (그림 2) ⁵ 만들고, 드문 비 고전 나타나는 세포의 염색 패턴 (모호한)에 의해 방해 할 수 있습니다. 이는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) GI 생검 조직과 GI 생검에....

프로토콜

임상 시험 심사위원회의 승인을 받아, 전자 실험실 데이터베이스의 검색은 위장에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염 사례 조직 병리학 진단 (GI) 생검 (헤 마톡 실린을 나타내는 (FFPE) 블록 및 임베디드 포르말린 고정, 파라핀을 확인하기 위해 수행되었다 에오신 (H & E) 및 / 또는 면역 조직 화학 (IHC)).

FFPE GI 생검 조직에서 1. 조직 처리

1. 사이토 메갈로 바이러스 (CMV)에 대한 FFPE GI 생검 조직 블록을 상환 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에). 이러한 블록을 실온에서 저장된다.
2. 블록의 고유 한 식별 번호와 함께 사전 라벨 1.7 밀리리터의 microfuge 튜브.
3. 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다.
4. 카세트 클램프로 조직 블록 좌석.
5. 신선하지 않는 블레이드를 사용하여 마이크로톰에 칼 각도로 블록을 맞 춥니 다.
6. 10 μm의 두께 부분을 잘라 마이크로톰을 조정합니다.
7. 일의 잠금을 해제전자 핸드 휠 미리 블레이드를 향해 블록.
8. 각각의 컷이 조직의 스크롤에 출시 할 수 있도록, 10 μm의 두께 간격으로 블록의 5 부분을 잘라냅니다. 각 스크롤 원하는 생검 조직....

결과

228 조직 블록의 총 모호 CMV IHC와 조직학 및 긍정적 인 면역 조직 화학 (IHC), 18 일을 기준으로 91 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 긍정적 인 사례로 구성되었다 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에), 79 음의 컨트롤에 의해 테스트되었습니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, CMV 양성 케이스 전형적인 CMV 바이러스 개재물 (A) 및 / 또는 양성 IHC 염색 (B)을 보여준 것이다. 음성 대조군이 더 의심스러운 조직 학적 또는 IHC 염색 ⁵ 표시되지 것입니다 반면 모호한 경우는 드문, 비 고전 나타나는 염색 패턴 (C)을 증명하고있다.

조직 병리학 CMV에 대한 긍정적 인 91 생검, 88 qPCR에 (표 2)에서 양성이었다. 기존의 조직학 기반으로 진정한 긍정적 인 정의와, .......

토론

많은 실험 방법은 혈청 학적 검사, 바이러스 배양, 분자 바이러스 혈증의 분석, 조직 검사 재료의 조직 학적, 그리고 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 (FFPE) 조직 검사 최근에 설명 된대로, 분자 분석을 포함하여 거대 세포 바이러스의 진단 (CMV) 감염을 사용할 수 있습니다 조직 ^5,6. 혈청 검사는 진단의 의지가 한 번 만 안정적으로 노출을 식별하고 급성 CMV 감염 ^7과 잘 상관하지 않습니다. 기존의 초기 항원 쉘 유리 병 모두 바이러스 성 문화, 후자 ^8의 경우 가장 2-3일에, 긴 분석 시간에 의해 방해된다. 분자 혈증 분석법은 대부분 모니터링 치료 효능 ^9-11위한 잠재력 정량적되는 장점을 갖는, 개발되고있다. 위장 (GI) 요로의 지역 참여에 대한 임상 우려가있을 때 불행하게도, 바이러스 혈증의 분석은 조직의 참여를 반영하고 구체적으로 지역화 감염을 식별하지 않습니다. 따라서, Histology은 위장관의 CMV 감염을 식별하기위.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.7 ml 마이크로퓨지 튜브	Costar	3620
톱니 겸	전자 현미경 서비스	62086-1S	마이크로 펜치 MF-1
탁상용 원심분리기(마이크로퓨지)	Eppendorf	5424
Xylene	Fisher	Fisher Scientific: X3P	1
에탄올	Fisher Fisher	Scientific: ET108	96-100%
Microtome	Leica	RM2255
QIAamp DNA FFPE 조직 키트	Qiagen	56404
artus CMV LightCycler PCR ASR	Qiagen	4500025
CMV LC PCR 보충 키트	Qiagen	1031873
LightCycler 원심분리기	Roche	75005087
LightCycler 냉각 블록	Roche
LightCycler 캡핑 도구	Roche	3357317
보정 키트	Roche	2158850
LightCycler 20 μ l 모세 혈관	Roche	1 909 339
블레이드	Sakura	Fisher Scientific : 4689	Accu-Edge 로우 프로파일

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