qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
Het is cruciaal om cytomegalovirus (CMV) hebben bij het gastro-intestinale (GI) stelsel van immunogecompromitteerde patiënten, gezien hun grotere kans op het ontwikkelen van ernstige infecties. Veel laboratoriummethoden voor de detectie van CMV-infectie ontwikkeld, waaronder serologie, virale cultuur en moleculaire methoden. Vaak zijn deze methoden reflecteren systemische betrokkenheid met CMV en niet specifiek identificeren lokale betrokkenheid weefsel. Daarom wordt de detectie van CMV-infectie in het maag-darmkanaal vaak gedaan door traditionele histologie van biopsie weefsel. Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring in combinatie met immunohistochemie (IHC) zijn de pijlers van onderzoek van deze biopten gebleven. H & E en IHC soms resulteren in atypische (dubbelzinnige) vlekken patronen, waardoor de interpretatie bemoeilijkt. Er werd aangetoond dat kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) voor CMV succes kan worden uitgevoerd op formaline-gefixeerd, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsel voor biopsie zeerhoge gevoeligheid en specificiteit. Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe qPCR testen uit te voeren voor de detectie van CMV in FFPE biopsie weefsel in een klinisch laboratorium setting. Deze werkwijze is waarschijnlijk van groot voordeel voor patiënten in gevallen van twijfelachtig kleuring CMV GI biopsieën.
Introduction
Interpretatie van cytomegalovirus (CMV) in klinische monsters is van cruciaal belang. CMV is een lid van de subfamilie van betaherpesvirinae herpesvirussen. Net als andere herpesvirussen, CMV heeft de mogelijkheid om hardnekkige of latente infectie te vestigen gekenmerkt door een gebrek aan actieve virale replicatie 1. Reactivering virus kan optreden in tijden van stress of andere immunosuppressie, waardoor actieve virale replicatie gekenmerkt door virion afgifte, eventueel vergezeld ziektemanifestaties 2-4. Gastro-intestinale (GI) CMV ziektesymptomen vaak buikpijn en / of bloederige ontlasting 1.
De diagnose van CMV gastro door histologie gebruikt hematoxyline en eosine (H & E) CMV virale insluitsels identificeren. In gevallen waarin klinisch vermoeden wordt hoog nog geen duidelijke insluitingen worden waargenomen, is immunohistochemie (IHC) vaak gebruikt als aanvulling testmethode. Echter, IHCkan ook worden belemmerd door zeldzame niet-klassieke verschijnen cellulaire kleuringspatronen (dubbelzinnig), waardoor de interpretatie moeilijk (figuur 2) 5. Er werd getracht DNA geëxtraheerd uit in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) GI biopsie weefsel en kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) CMV detecteren GI biopsieën gebruiken. Deze techniek is gebleken waardevol bij de detectie van CMV in GI biopsieën, en is bijzonder nuttig in gevallen onduidelijke IHC 5,6. Ook is qPCR ook aangetoond goed correleren met aanvullende klinische CMV testgegevens wanneer het beschikbaar 6. Gebruik van qPCR opsporen CMV kan leiden tot een vroegere diagnose en behandeling wanneer klinisch vermoeden CMV is hoog, maar H & E en CMV IHC negatief.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veel laboratoria methoden beschikbaar zijn voor de diagnose van cytomegalovirus (CMV), waaronder serologie, virale cultuur, moleculaire viremie testen histologie biopsie materiaal en, zoals onlangs aangetoond moleculaire analyses van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) biopsie weefsel 5,6. Serologie, ooit een steunpilaar van de diagnose, alleen betrouwbaar identificeert blootstelling en niet goed correleert met een acute CMV-infectie 7. Viruskweek, zowel conventionele als vroege antige…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen Amy Thomasson voor haar hulp bij de voorbereiding van dit manuscript, en Fredrik Skarstedt en Ryan Christy voor hun inspanningen bij de voorbereiding van de cijfers.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
- Hodinka, R. L. . Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
