Sitoplazmik DNA Algılama Pathways uyarılması<em> İn Vitro</em> Ve<em> In Vivo</em
Summary
Protokolün amacı hücrelerin in vivo ve in sitoplazmik DNA algılama yolları uyarılması için uygun yöntemler kullanılmasıdır. Bu uç ligasyonu içinde uzun bir çift şeritli DNA oluşumunu geliştirerek elde edilir. Hücreler daha sonra ya da farenin bir lipit transfeksiyon ayıracı kullanılarak transfekte edilir.
Abstract
Etkili bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisini uyarmak için, DNA, yeterli uzunluk ve saflıkta olmalıdır. Biz, gerekli özelliklere sahip çift sarmallı DNA (dsDNA) algılama yolları ucuz ve kolaylıkla oluşturulabilir sitoplazmik DNA teşvik etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Kısa sentetik oligonükleotidlerin (CpG motifleri eksik olan) en concatemerization ile, dsDNA sitosolik DNA algılama yolunu aktive etmek için yeterli bir uzunluğa sahip olması elde edilebilir. Bu protokol, etkili bir ligasyon meydana gelmesi için bir ortam sağlar polietilen glikol varlığında (PEG) içinde oligonükleotidlerin kör uç ligasyonu içerir. DsDNA karakterlerini, standart transfeksiyon protokolleri ile, in vitro olarak doğuştan gelen bağışıklık tepkisini için, fenol / kloroform ekstraksiyonu ile saflaştırma işleminden sonra, kullanılabilir. Bu DNA, aynı zamanda, örneğin, bir fare kulak kepçesine intradermal enjeksiyon yolu ile, in vivo doğal bağışıklığı uyarmak için kullanılabilir. Tarafındanconcatemerization işlemi ve daha sonraki stimülasyon protokolleri standartlaştırılması, doğuştan gelen bağışıklık sistemi, güvenilir ve yeniden üretilebilir bir aktivasyona üretilebilir.
Introduction
DNA ökaryotlarda özel bölmelere tutmak tüm organizmalar ve hücrelerin, önemli bir bileşenidir. Bu bölmelere ayırır ya da zaman doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasında bir fonksiyonu, tanımlanması için bir yabancı madde, fiziksel, dış engelleri ihlal ile organizma içine sokulduğunda. İnsan vücudunda doğru compartmentalization kaçabilir DNA'nın küçük miktarlarda düşmesine yardımcı olmak için vardır proteinlerin bir dizi vardır; DNAz I, II ve III, plazma, endozoma ve sitozol içinde DNA break down. Ancak, doğuştan gelen bağışıklık sistemi ekstra nükleer DNA tepki verdiğini DNAz II eksik farenin düşündüren interferonlar 1 aşırı üretimine yol açtığı şiddetli anemi ölmektedir olduğu gösterilmiştir. Bu yanıt, daha da Toll-benzeri reseptör sinyal kapasitesi tamamen eksik olan farelerde görülür. Çeşitli çalışmalar şimdi interferon genleri (STING) 2 ve TANK-bağlayıcı kinaz 1 (TB olduğunu uyarıcı göstermiştirK1) 3 sitoplazmada DNA'nın saptanması ve bu sinyal yolunun, interferon ayarlayıcı faktör (IRF) -3 4 aktive katılmaktadırlar. Sitokin, kemokin, ve interferon gen daha sonra IRF3 bağımlı transkripsiyon, bir patojen ya da tehlike ilişkili moleküler model (PAMP ya da ıslak) 5 ya da doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin özelliğidir.
Hücre içi nükleik asit algılama yollan araştırmak için arzu diğer doğal immün yanıtları aktive olmayan hücrelere DNA ya da RNA'nın hücrelere verilmesi ile teşvik etmek için sağlam ve tekrarlanabilir yöntemler geliştirmeye ihtiyacına yol açmıştır. / Sokması TBK1 / IRF3 yolu uyarılabilir hangi bir yöntemi, bu, DNA-PK, IFI16 ve CGAS 6-8 gibi DNA sensörleri tarafından erişilebilir sitoplazmaya nükleik asit sağlamak üzere katyonik lipit transfeksiyon reaktifleri kullanılarak gereğidir.
Şu anda eff izin vermek için anlaşılır DNA özellikleriDiğer yolların uyarımı olmaksızın sitoplazmik tabii immun cevabın aktivasyonu icient CpG uzunluğu, kütle, saflık ve eksik 4,7,9 motifleridir. Sentetik oligonükleotidlerin, optimize edilmiş DNA dizisi ve saf kimyasal türler gibi hazırlanabilir izin olarak doğuştan gelen bağışıklık tepkisi üretmek amacı için oldukça uygundurlar. Bir 45 baz çift immüno-uyarıcı DNA (ISD) dizisi, bu amaç için uygun bir CpG içermeyen sekans olarak şapkalı ve ark. 4 ile teşhis edildi. Bu dsDNA dizi aksi takdirde rastgele ve CpG motifleri onun eksikliği dışında hiçbir özel özellikleri vardır. Bu önemli ölçüde daha uzun şeritler haline ISD oligonükleotid concatemerizing tarafından uyarılması 7 büyüklüğünü arttırdığını bulduk. Concatemerized ISD Üretimi sitoplazmik bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin uyarılması için faydalıdır. Burada bu reaktifinin hazırlanması için protokoller sunulmuş ve bu DNA algılama yolunu aktive etmek için kullanılabilir nasılin vivo ve in vitro.
NOT: Tüm hayvan çalışmaları onaylanan kurumsal protokollere ve hayvan bakımı kurallar altında yapılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokoller hücre tiplerinin geniş bir yelpazede ve in vivo olarak yeniden üretilebilir sonuçlar sitosolik doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için dsDNA oluşturmak için kullanılır. Ikinci ana tabaka reaktif bir sentetik oligonükleotid olduğu, alternatif bir DNA sekanslarını veya kimyasal modifikasyonlar için, bu sistemde bir esneklik elde edilir. Bu, örneğin, bir flüoresan etiket veya lokalizasyonunu etiket ya da diğer biyomoleküllerle etkileşiminin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bildirimleri var.
Materials
| Forward Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | |
| Phenol:Chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel loading buffer | New England biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
| 30G needles | BD bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
| First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
References
- Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H., Nagata, S. Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA. Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005).
- Ishikawa, H., Ma, Z., Barber, G. N. STING regulates intracellular DNA-mediated, type I interferon-dependent innate immunity. Nature. 461, 788-792 (2009).
- Ishii, K. J., et al. TANK-binding kinase-1 delineates innate and adaptive immune responses to DNA vaccines. Nature. 451, 725-729 (2008).
- Stetson, D. B., Medzhitov, R. Recognition of cytosolic DNA activates an IRF3-dependent innate immune response. Immunity. 24, 93-103 (2006).
- Pichlmair, A., Reise Sousa, C. Innate recognition of viruses. Immunity. 27, 370-383 (2007).
- Unterholzner, L., et al. IFI16 is an innate immune sensor for intracellular DNA. Nat. Immunol. 11, 997-1004 (2010).
- Ferguson, B. J., Mansur, D. S., Peters, N. E., Ren, H., Smith, G. L. DNA-PK is a DNA sensor for IRF-3-dependent innate immunity. Elife. 1, e00047 (2012).
- Sun, L., Wu, J., Du, F., Chen, X., Chen, Z. J. Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway. Science. 339, 786-791 (2013).
- Honda, K., Taniguchi, T. IRFs: master regulators of signalling by Toll-like receptors and cytosolic pattern-recognition receptors. Nat. Rev. Immunol. 6, 644-658 (2006).
- Karayel, E., et al. The TLR-independent DNA recognition pathway in murine macrophages: Ligand features and molecular signature. Eur. J. Immunol. 39, 1929-1936 (2009).
