La stimolazione dei citoplasmatici DNA Sensing Pathways<em> In Vitro</em> E<em> In Vivo</em

Summary

L'obiettivo del protocollo è quello di utilizzare metodi ottimali per stimolare i percorsi citoplasmatici rilevamento del DNA in cellule e in vivo. Questo risultato è ottenuto migliorando la generazione di lunga, il DNA a doppio filamento durante blunt-end legatura. Le cellule o topi sono poi transfettate con un reagente di trasfezione lipidico.

Abstract

Al fine di stimolare efficacemente una risposta immunitaria innata, il DNA deve essere di lunghezza e purezza sufficiente. Vi presentiamo un metodo in cui DNA a doppia elica (dsDNA), che ha le caratteristiche necessarie per stimolare il DNA citoplasmatico percorsi di rilevamento possono essere generati a basso costo e con facilità. Con la concatemerization di brevi oligonucleotidi sintetici (che manca motivi CpG), dsDNA possono essere generati per essere di lunghezza sufficiente per attivare il rilevamento del DNA citosolico percorso. Questo protocollo prevede la legatura punta smussata degli oligonucleotidi in presenza di polietilene glicole (PEG), che fornisce un ambiente per la legatura efficiente a verificarsi. Le concatemers dsDNA possono essere utilizzati, a seguito purificazione per estrazione con fenolo / cloroformio, per simulare la risposta immunitaria innata in vitro da protocolli di trasfezione standard. Questo DNA può anche essere utilizzato per stimolare l'immunità innata in vivo mediante iniezione intradermica nel padiglione auricolare di un mouse, per esempio. Dastandardizzare il processo concatemerization e protocolli di stimolazione successivi, l'attivazione affidabile e riproducibile del sistema immunitario innato può essere prodotta.

Introduction

Il DNA è una componente vitale di tutti gli organismi e le cellule eucarioti, che mantengono in compartimenti specifici. Una funzione del sistema immunitario innato è quello di individuare quando tale compartimentazione si rompe o quando il materiale estraneo viene introdotto nell'organismo attraverso una violazione delle barriere fisiche, esterni. Nel corpo umano ci sono una serie di proteine ​​che esistono per aiutare a degradare piccole quantità di DNA che possono sfuggire alla compartimentazione corretta; DNAsi I, II, e III abbattere DNA nel plasma, endosome, e citosol, rispettivamente. Tuttavia, è stato dimostrato che i topi privi DNAse II muoiono da grave anemia causata da eccessiva produzione di interferoni ¹ suggeriscono che il sistema immunitario innato risponde a DNA extra-nucleare. Questa risposta si verifica anche nei topi, che sono del tutto carenti di capacità di segnalazione dei recettori toll-like. Numerosi studi hanno ormai dimostrato che stimolatore dei geni interferone (STING) ² e-TANK vincolante chinasi 1 (TBK1) ³ sono coinvolti nella rilevazione del DNA nel citoplasma e che questa via di segnalazione attiva interferon fattore di regolazione (IRF) -3 ^4. La successiva trascrizione IRF3-dipendente di citochine, chemochine, e geni interferone è caratteristico di una risposta immunitaria innata, o un agente patogeno o di pericolo associato modello molecolare (PAMP o umido) ^5.

Il desiderio di studiare intracellulari nucleici percorsi di rilevamento acido ha portato alla necessità di sviluppare metodi affidabili e riproducibili per stimolare le cellule con l'introduzione di DNA o RNA nelle cellule senza attivare altre risposte immunitarie innate. Un metodo con cui il STING / TBK1 / IRF3 percorso possono essere stimolati sia utilizzando cationici reagenti di trasfezione lipidico per fornire acido nucleico nel citoplasma, dove si può accedere da sensori di DNA come il DNA-PK, IFI16, e CGAs ^6-8.

Le caratteristiche del DNA che sono attualmente compresi per consentire effl'attivazione icient della risposta immunitaria innata citoplasmatica senza stimolazione di altre vie sono la sua lunghezza, massa, la purezza, e la mancanza di CpG motivi ^4,7,9. Oligonucleotidi sintetici sono altamente adatti allo scopo di generare una risposta immunitaria innata quanto permettono la sequenza di DNA di ottimizzare e preparato come una specie chimica pura. Un immuno-stimolante DNA (ISD) sequenza di 45 coppie di basi è stato identificato da Stetson et al. ⁴ come un adeguato, sequenza CpG-libero per questo scopo. Questa sequenza dsDNA è altrimenti casuale e non ha caratteristiche specifiche di là della sua mancanza di motivi CpG. Abbiamo trovato che concatemerizing l'oligonucleotide DSI in fili significativamente più lunghi aumenta l'ampiezza della stimolazione ^7. Generazione di ISD concatemerized è quindi utile per stimolare una risposta immunitaria innata citoplasmatica. Qui vi presentiamo i protocolli per la preparazione di questo reagente e come può essere utilizzato per attivare il percorso di rilevamento del DNA invitro e in vivo.

NOTA: Tutti gli studi sugli animali vengono eseguiti secondo protocolli istituzionali approvate e linee guida per la cura degli animali.

Protocol

1 Concatemerization Risospendere primer Fw e Rv (vedere Tabella dei materiali per le sequenze dei primer) ad una concentrazione di 10 mg / mL in biologia molecolare di grado H 2 O. Poi, mescolare 5 ml di Fw e 5 ml di Rv innesco in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Miscela di primer Anneal mediante riscaldamento alla temperatura di ricottura corretta (75 ° C per i primers descritti) per 15 min. Lasciare in panchina per raffreddare a temperatura ambiente (RT). Preparare la PEG8000 de…

Representative Results

I risultati seguenti indicano che il DNA concatemerized può essere generato con relativa facilità ed è in grado di stimolare una risposta immunitaria innata robusta nelle cellule e nei topi. Con l'uso di PEG8000, si vede chiaramente che la lunghezza del DNA generato è significativamente più lungo e ugualmente in grado di indurre la trascrizione di CXCL10. Come si vede dalle analisi su gel di agarosio, il concatemerization standard ha lunghezze di DNA di 800 paia di basi (bp), mentre per il campione con PE…

Discussion

I protocolli qui descritti sono utilizzati per generare dsDNA per stimolare la risposta immunitaria innata citosolico con risultati riproducibili in una vasta gamma di tipi cellulari che in vivo. Poiché il principale reagente substrato utilizzato è un oligonucleotide sintetico, vi è la flessibilità in questo sistema per l'utilizzo di sequenze di DNA alternative o modificazioni chimiche. E 'possibile, per esempio, per sostituire l'oligonucleotide filo avanti descritto in questo protocollo con uno…

Materials

Forward Primer	Integrated DNA technologies	n/a	TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA
Reverse Primer	Integrated DNA technologies	n/a	TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA
PEG8000	Sigma-Aldrich	P-4463
Molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502-1L
T4 Polynucleotide Kinase	Promega	M4101
T4 DNA Ligase	Promega	M1801
Phenol:Chloroform	Fisher Chemical	BPE1752p-400
Chloroform	Fisher Chemical	C/4960/PB08
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-2.5L
DNA gel loading buffer	New England biolabs	B7021S
Agarose	Bioline	BIO-41025
Optimem	Life Technologies	11058021
TransIT-LT1	Mirus Bioscience	MIR 2300
Hamilton Syringe	Hamilton	80901 Model 1705
30G needles	BD bioscience	304000
SYBR Safe DNA gel stain	Life Technologies	S33102
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134
Oligo(dT) primer	Thermo Scientific	SO131
dNTP mix	Fermentas	R0192
Super Script III reverse transcriptase	Life Technologies	56575
First strand cDNA synthesis buffer	Life Technologies	y02321
SybrGreen qPCR Fast master mix	Applied Biosystems	4385612
cxcl10 murine forward primer	Integrated DNA technologies	n/a	ACTGCATCCATATCGATGAC
cxcl10 murine reverse primer	Integrated DNA technologies	n/a	TTCATCGTGGCAATGATCTC
il6 murine forward primer	Integrated DNA technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC
il6 murine forward primer	Integrated DNA technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC