Stimulering av cytoplasmatiske DNA Sensing Pathways<em> In Vitro</em> Og<em> In Vivo</em

Summary

Formålet med protokollen er å bruke optimale fremgangsmåter for å stimulere de cytoplasmiske DNA føler trasé i celler og in vivo. Dette oppnås ved å forbedre genereringen av lange, dobbeltkjedet DNA ved butt-ende ligering. Celler eller mus blir deretter transfektert ved hjelp av en lipid transfeksjon reagens.

Abstract

For effektivt å stimulere en medfødte immunrespons, må DNA være av tilstrekkelig lengde og renhet. Vi presenterer en metode hvor dobbelt-trådet DNA (dsDNA), som har de nødvendige egenskaper for å stimulere cytoplasmisk DNA føler trasé kan genereres billig og på en enkel måte. Ved concatemerization av korte, syntetiske oligonukleotider (som mangler CpG motiver), kan dsDNA bli generert til å være av tilstrekkelig lengde for å aktivere den cytosoliske DNA føle pathway. Denne protokoll omfatter butt ende ligering av oligonukleotidene i nærvær av polyetylenglykol (PEG), som gir et effektivt miljø for ligering til å forekomme. De dsDNA concatemers kan anvendes, etter rensing ved fenol / kloroform ekstraksjon, for å simulere den medfødte immunrespons in vitro ved hjelp av standard protokoller transfeksjon. Dette DNA kan også brukes til å stimulere medfødt immunitet in vivo ved intradermal injeksjon i øret pinna av en mus, for eksempel. Avstandardisere concatemerization prosessen og den etterfølgende stimuleringsregimer, kan en pålitelig og reproduserbar aktivering av den medfødte immunsystemet bli produsert.

Introduction

DNA er en viktig komponent i alle organismer og celler, som eukaryoter holder i bestemte avdelinger. En funksjon av den medfødte immunsystemet, er å identifisere når en slik compartmentalization bryter ned eller når fremmed materiale blir innført inn i organismen via et brudd på fysiske, ytre barrierer. I menneskekroppen er det en rekke proteiner som finnes å bidra til å degradere små mengder av DNA som kan unnslippe korrekt compartmentalization; DNAse I, II og III bryte ned DNA i plasma, endosome, og cytosol, respektivt. Imidlertid har det vist seg at mus som mangler DNAse II dør av alvorlig anemi forårsaket av overdreven produksjon av interferoner ^en som tyder på at det medfødte immunsystemet reagerer på ekstra-kjerne-DNA. Denne responsen skjer selv hos mus som er helt mangelfull i toll-like receptor signalkapasitet. Tallrike studier har nå vist at stimulator av interferon gener (STING) ² og TANK-bindende kinase 1 (TBK1) ³ er involvert i gjenkjenning av DNA i cytoplasma, og at denne signalveien aktiveres interferon regulerende faktor (IRF) -3 ^4. Den påfølgende IRF3 avhengige transkripsjon av cytokin, kjemokinet og interferon gener er karakteristisk for en medfødt immunrespons mot enten et patogen eller fare forbundet molekylær mønster (PAMP eller fuktig) ^5.

Ønsket om å studere intracellulære nukleinsyre sensing veier har ført til kravet om å utvikle robuste og reproduserbare metoder for å stimulere cellene ved å innføre DNA eller RNA inn i celler uten å aktivere andre medfødte immunresponser. En metode der STING / TBK1 / IRF3 pathway kan stimuleres er ved hjelp av kationiske lipid transfeksjon reagenser å levere nukleinsyre i cytoplasma hvor den kan nås av DNA-sensorer som DNA-PK, IFI16, og CGAS ^6-8.

Karakteristikken av DNA som nå er forstått å tillate efficient aktivering av cytoplasma medfødte immunrespons uten stimulering av andre banene er dens lengde, masse, renhet og mangel på CpG motiver ^4,7,9. Syntetiske oligonukleotider er godt egnet for det formål å generere en medfødte immunrespons som de tillater at DNA-sekvensen som skal optimaliseres, og fremstilt som en ren kjemisk species. En 45 basepar immuno-stimulerende DNA (ISD) sekvensen ble identifisert ved Stetson et al. ^Fire som å være et egnet, CpG-fri sekvens for dette formål. Dette dsDNA sekvensen er ellers tilfeldig og har ingen spesifikke funksjoner utover sin mangel på CpG motiver. Vi har funnet at ved concatemerizing ISD oligonukleotid inn betydelig lengre tråder øker omfanget av stimulering ^7. Generering av concatemerized ISD er derfor nyttig for å stimulere en cytoplasma medfødte immunrespons. Her presenterer vi protokoller for utarbeidelsen av denne reagensen og hvordan den kan brukes til å aktivere DNA sensing veien ivitro samt in vivo.

MERK: Alle dyrestudier er utført under godkjente institusjonelle protokoller og retningslinjer dyr omsorg.

Protocol

1. Concatemerization Suspender primere Fw og Rv (se tabell for material for primer sekvenser) til en konsentrasjon på 10 mikrogram / ​​mL i molekylærbiologi klasse H 2 O. Deretter blandes 5 pl av Fw og 5 pl av Rv primer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Anneal primerblanding ved oppvarming til den riktige annealing temperatur (75 ° C for de primere som er beskrevet her) i 15 min. La på benken for å kjøle seg ned i romtemperatur (RT). Klargjør 60% PEG8000 i løpet av denne inkuba…

Representative Results

Resultatene nedenfor viser at concatemerized DNA kan bli generert relativt enkelt, og er i stand til å stimulere en robust medfødte immunrespons i celler og hos mus. Med bruk av PEG8000, kan det tydelig ses at lengden av DNA som genereres er vesentlig lengre og like i stand til å indusere transkripsjon av Cxcl10. Som det fremgår av agarosegel-analyse, har standard concatemerization lengder av DNA på opp til 800 basepar (bp), mens det for prøven med PEG8000, lengden av DNA omfatter tråder i overkant av 10 00…

Discussion

De protokoller som er beskrevet her, blir brukt til å generere dsDNA å stimulere cytosoliske medfødte immunrespons med reproduserbare resultater i et stort utvalg av celletyper og in vivo. Siden den viktigste substrat reagens som anvendes er en syntetisk oligonukleotid, har det fleksibiliteten i dette system for å bruke alternative DNA-sekvenser eller kjemiske modifikasjoner. Det er mulig, for eksempel, for å erstatte den fremre otidet beskrevet i denne protokoll med en som inneholder en fluorescerende mar…

Materials

Forward Primer	Integrated DNA technologies	n/a	TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA
Reverse Primer	Integrated DNA technologies	n/a	TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA
PEG8000	Sigma-Aldrich	P-4463
Molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502-1L
T4 Polynucleotide Kinase	Promega	M4101
T4 DNA Ligase	Promega	M1801
Phenol:Chloroform	Fisher Chemical	BPE1752p-400
Chloroform	Fisher Chemical	C/4960/PB08
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-2.5L
DNA gel loading buffer	New England biolabs	B7021S
Agarose	Bioline	BIO-41025
Optimem	Life Technologies	11058021
TransIT-LT1	Mirus Bioscience	MIR 2300
Hamilton Syringe	Hamilton	80901 Model 1705
30G needles	BD bioscience	304000
SYBR Safe DNA gel stain	Life Technologies	S33102
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134
Oligo(dT) primer	Thermo Scientific	SO131
dNTP mix	Fermentas	R0192
Super Script III reverse transcriptase	Life Technologies	56575
First strand cDNA synthesis buffer	Life Technologies	y02321
SybrGreen qPCR Fast master mix	Applied Biosystems	4385612
cxcl10 murine forward primer	Integrated DNA technologies	n/a	ACTGCATCCATATCGATGAC
cxcl10 murine reverse primer	Integrated DNA technologies	n/a	TTCATCGTGGCAATGATCTC
il6 murine forward primer	Integrated DNA technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC
il6 murine forward primer	Integrated DNA technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC