Stimulering av Cytoplasmatiska DNA Sensing Pathways<em> In Vitro</em> Och<em> In Vivo</em
Summary
Syftet med protokollet är att använda optimala metoder för att stimulera de cytoplasmiska DNA kännande vägar i celler och in vivo. Detta uppnås genom att förbättra alstringen av långa, dubbelsträngade DNA under trubbig ände-ligering. Celler eller möss transfekteras sedan med användning av en lipid transfektion reagens.
Abstract
För att effektivt stimulera ett inneboende immunsvar, måste DNA vara av tillräcklig längd och renhet. Vi presenterar en metod där dubbelsträngat DNA (dsDNA), som har de egenskaper som krävs för att stimulera cytoplasma DNA kännande vägar kan genereras billigt och enkelt. Förre concatemerization av korta, syntetiska oligonukleotider (vilka saknar CpG-motiv) kan dsDNA genereras för att ha tillräcklig längd för att aktivera den cytosoliska DNA avkänning vägen. Detta protokoll involverar trubbig ände-ligering av oligonukleotiderna i närvaro av polyetylenglykol (PEG), som tillhandahåller en miljö för effektiv ligering skall ske. De dsDNA konkatemerer kan användas, efter rening genom fenol / kloroform-extraktion, för att simulera det medfödda immunsvar in vitro genom vanliga transfektions-protokoll. Detta DNA kan också användas för att stimulera det medfödda immunförsvaret in vivo genom intradermal injektion i ytterörat hos en mus, till exempel. Genomstandardisera concatemerization processen och de efterföljande stimuleringsprotokoll, kan produceras en tillförlitlig och reproducerbar aktivering av det medfödda immunsystemet.
Introduction
DNA är en viktig komponent i alla organismer och celler, vilka eukaryoter hålla i särskilda fack. En funktion av det medfödda immunförsvaret är att identifiera när en sådan uppdelning går sönder eller när främmande material införs i organismen via en överträdelse av fysiska, yttre hinder. I människokroppen finns det ett antal proteiner som finns för att hjälpa bryta ned små mängder DNA som kan komma rätt uppdelning; DNAs I, II och III bryta ned DNA i plasma, endosomen, och cytosol, respektive. Det har dock visat sig att möss som saknar DNAse II dör av svår blodbrist som orsakas av överproduktion av interferoner 1 tyder på att det medfödda immunförsvaret reagerar på extra-nukleärt DNA. Detta inträffar även hos möss som är helt saknar toll-liknande kapacitet receptorsignalering. Ett stort antal studier har nu visat att stimulator av interferongener (STING) 2 och TANK-bindande kinas 1 (TBK1) 3 är involverade vid detektering av DNA i cytoplasman och att denna signalväg aktiverar interferonreglerande faktor (IRF) -3 4. Den efterföljande IRF3 beroende transkription av cytokin, kemokin och interferongener är kännetecknande för en medfödd immunsvar mot antingen en patogen eller fara molekylära mönster (PAMP eller DAMP) 5.
Viljan att studera intracellulära nukleinsyra kännande vägar har lett till krav på att utveckla robusta och reproducerbara metoder för att stimulera celler genom att införa DNA eller RNA i celler utan att aktivera andra medfödda immunsvar. En metod som STING / TBK1 / IRF3 vägen kan stimuleras är att använda katjoniska lipid transfektionsreagens att leverera nukleinsyra i cytoplasman där den kan nås av DNA-sensorer såsom DNA-PK, IFI16 och cgas 6-8.
Egenskaperna hos DNA, som för närvarande förstås att medge efficient aktivering av cytoplasma medfödda immunsvar utan stimulering av andra vägar är dess längd, vikt, renhet och avsaknad av CpG-motiv 4,7,9. Syntetiska oligonukleotider är mycket lämpliga i syfte att alstra en medfödd immunsvar som de tillåter den DNA-sekvens, som skall optimeras och framställd som en ren kemisk art. En 45 baspar immuno-stimulatoriska DNA (ISD) sekvensen identifierades genom Stetson et al. Fyra som en lämplig, CpG-fri sekvens för detta syfte. Denna dsDNA sekvens är annars slumpmässig och har inga särskilda egenskaper utöver sin brist på CpG-motiv. Vi har funnit att genom concatemerizing ISD oligonukleotiden i signifikant längre strängarna ökar magnituden av stimuleringen 7. Generering av concatemerized ISD är därför användbart för att stimulera en cytoplasmatisk medfödda immunsvar. Här presenterar vi protokoll för att förbereda detta reagens och hur den kan användas för att aktivera DNA avkänning vägenvitro såväl som in vivo.
OBS: Alla djurförsök utförs under godkända institutionella protokoll och riktlinjer djurvårds.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protokoll som beskrivs här används för att generera dsDNA att stimulera cytosoliskt medfödda immunsvar med reproducerbara resultat i en rad olika celltyper och in vivo. Eftersom huvud substratreagenset som används är en syntetisk oligonukleotid, det finns flexibilitet i detta system för att använda alternativa DNA-sekvenser eller kemiska modifieringar. Det är möjligt, till exempel, för att ersätta den främre strängen oligonukleotiden beskrivs i detta protokoll med en som innehåller en fluoresc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Forward Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | |
| Phenol:Chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel loading buffer | New England biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
| 30G needles | BD bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
| First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
References
- Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H., Nagata, S. Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA. Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005).
- Ishikawa, H., Ma, Z., Barber, G. N. STING regulates intracellular DNA-mediated, type I interferon-dependent innate immunity. Nature. 461, 788-792 (2009).
- Ishii, K. J., et al. TANK-binding kinase-1 delineates innate and adaptive immune responses to DNA vaccines. Nature. 451, 725-729 (2008).
- Stetson, D. B., Medzhitov, R. Recognition of cytosolic DNA activates an IRF3-dependent innate immune response. Immunity. 24, 93-103 (2006).
- Pichlmair, A., Reise Sousa, C. Innate recognition of viruses. Immunity. 27, 370-383 (2007).
- Unterholzner, L., et al. IFI16 is an innate immune sensor for intracellular DNA. Nat. Immunol. 11, 997-1004 (2010).
- Ferguson, B. J., Mansur, D. S., Peters, N. E., Ren, H., Smith, G. L. DNA-PK is a DNA sensor for IRF-3-dependent innate immunity. Elife. 1, e00047 (2012).
- Sun, L., Wu, J., Du, F., Chen, X., Chen, Z. J. Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway. Science. 339, 786-791 (2013).
- Honda, K., Taniguchi, T. IRFs: master regulators of signalling by Toll-like receptors and cytosolic pattern-recognition receptors. Nat. Rev. Immunol. 6, 644-658 (2006).
- Karayel, E., et al. The TLR-independent DNA recognition pathway in murine macrophages: Ligand features and molecular signature. Eur. J. Immunol. 39, 1929-1936 (2009).
