Комплексный анализ транскрипции Dynamics от мозга образцов После поведенческой Опыт
Summary
This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.
Abstract
Кодирование опытом в головном мозге и консолидации долгосрочной памяти зависит от транскрипции генов. Определение функции специфических генов в опыте кодирования является одним из основных задач молекулярной нейробиологии. Кроме того, функциональная ассоциация определенных генов с конкретными поведения имеет значение для понимания основ нервно-психических расстройств. Индукционная надежных программ транскрипции наблюдалось в мозге мышей следующих различные поведенческие манипуляции. В то время как некоторые генетические элементы используются периодически следующих различных поведенческих манипуляций и в различных ядер головного мозга, транскрипционные программы в целом уникальным для индуцирующих стимулов и структуры, в котором они изучаются 1,2.
В этой публикации, протокол описан для надежной и всеобъемлющей транскрипции профилирования из мозга зародышей мышей в ответ на манипуляции поведенческих.Протокол продемонстрирована в контексте анализа динамики экспрессии генов в прилежащем ядре после острого опыт кокаина. После определено в естественных условиях опыта, целевой нервной ткани рассекают; с последующей очисткой РНК, обратная транскрипция и использования микрофлюидных массивов для комплексного КПЦР анализа нескольких генов-мишеней. Этот протокол направлена на всестороннее анализа (адресации 50-500 генов) ограничения количества исходного материала, таких как небольшие образцов мозга или даже отдельных клеток.
Протокол является наиболее выгодным для параллельного анализа нескольких образцов (например одиночных клеток, динамического анализа следующей фармацевтической, вирусной или поведенческих возмущений). Тем не менее, протокол также мог бы служить для характеризации и контроля качества образцов до целого генома исследованиях микрочипов или RNAseq, а также проверка данных, полученных из цельного исследований генома.
Introduction
Динамичной организацией мозгом позволяет когнитивные и поведенческие гибкость. Опыт кодируются путем изменения структуры и прочности связей между нейронами в мозге 3. Это "опыт-зависимой пластичности" является результатом индукции специфических форм генной экспрессии, что обеспечивает необходимые белки для модификации синаптической структуре и прочности 4. Идентификация генов регуляторных сетей посредником образование долгосрочной памяти является центральным принципом молекулярной нейробиологии, с ожиданием, что идентификация доминирующих элементов транскрипционных программ обеспечит понимание основных принципов, регулирующих формирование памяти, а также целевые показатели для лечение нейродегенеративных и психоневрологических расстройств. Транскрипции программы развернется в временно-определенных волн, каждая из которых кодирует гены разного характера, которые важны для гifferent этапы реализации исхода данного события сигнализации 1,2. Поэтому важно, чтобы обратиться транскрипционные динамику на детальном временном масштабе времени, с тем чтобы определить полный набор генов, индуцированных, и разобраться в их потенциальной функции в соответствии с динамикой их индукции.
Наркомания является надежной формой зависящей от опыта пластичности, вызванного долговременными последствиями злоупотреблением наркотиками на нейронных цепей в мозгу 5,6. Начальное, острое воздействие препаратов может привести к развитию наркомании и переход к хроническим использования. Контекстной информации является ключевым элементом в развитии наркомании. Связанных с наркотиками средовые сигналы назначаются важное значение в сознании наркоманов. Контекстная информация напоминая наркоманом прошлого опыта наркотиков может вызывать рецидив к наркотиков тягу даже после длительных периодов воздержания от наркотиков воздействия 7,8.Поэтому великий клинической проблемой в зависимости – склонность наркоманов к рецидиву даже долгое время после снятия симптомов убыль 9.
Поведенческая сенсибилизация к кокаину является простая модель кокаина опыта полезной при изучении механизмов наркомании. В этом широко изученной модели для длительной сенсибилизации, вызванной хроническим воздействием наркотиков, вызывающих зависимость, грызуны сначала приучали к засоленных инъекций (внутрибрюшинными; IP) в новой среде (открытой полевой камеры, в которой их двигательную активность контролируется) ; Затем, они получают ежедневные инъекции кокаина в камерах открытом пространстве в то время как их деятельность контролируется 10 (рисунок 1). Это поведенческая парадигма обычно приводит в прочном сенсибилизации поведения опорно-двигательного (8-12 раз выше базовой деятельности) 11, который ведется в течение нескольких месяцев после прекращения приема кокаина инъекций, демонстрируя образование извращенецasive след памяти опыта наркотиков.
Нейронная схема вознаграждения, естественно участие в укреплении поведения, необходимые для успеха того или иного вида (например, подачи, секс), эксплуатируется злоупотреблением наркотиками укрепления наркотиками связаны с поведением 12,13. Молекулярные и клеточные механизмы, с помощью которых опыт злоупотреблением наркотиками усиливается, кажется, похожи на механизмы, лежащие образование декларативных или семантических воспоминаний в других структурах мозга 14. Таким образом, надежность поведенческой модели сенсибилизации делает его привлекательным модельную систему для изучения механизмов зависящей от опыта пластичности.
Прилежащем ядре (NAC) является центральным интегратор награду схемы мозга, и была широко ассоциируется с развитием наркомании 5,6. Формирование наркомании зависит от транскрипции новых белков в прилежащем ядре, и надежная вводство четко структурированных программ транскрипции наблюдается в NAc следующие кокаина опыта 15-19. Острая транскрипции ответ на воздействия кокаина, вероятно, работать на нескольких уровнях для того, чтобы адаптироваться к сильной индукции стимула и направить производство новых белков, которые несут ответственность за структурные и электрофизиологических изменений, вызванных воздействием препарата 6,19-22.
В целях содействия изучению молекулярных механизмов зависящей от опыта пластичности в мозге, протокол описывается для всестороннего анализа динамики транскрипции в пробах мозговой ткани следующем поведенческой манипуляции. Протокол иллюстрируется в контексте поведенческой опыта исследуемой в лаборатории Citri – поведенческой чувствительности к кокаину, используя микрофлюидных динамические массивы для транскрипции анализа. Протокол описано, очевидно, не ограничивается изучением тОн прилежащем ядре в контексте поведенческой сенсибилизации, но может быть применен к большому числу поведенческих парадигм и областей головного мозга. В самом деле, этот протокол может быть применен к ткани тела вне мозга, а также различные опыте или манипуляций организма изучены.
Протокол грубо разделить на четыре стадии. На первом этапе, животное подвергают поведенческой парадигмы; на втором этапе ткань микродиссекции; на третьем этапе – мРНК очищенная, обратной транскрипции и зондируют, и на конечной стадии данные анализируются.
В контексте изучения транскрипционных динамику, точные сроки и определение опыта, вероятно, наиболее важные экспериментальные параметры для управления. По этой причине, наша модель поведения выбора является то, что поведенческой чувствительности к кокаину, системы, которая обеспечивает высокую степень контроля над экспериментатора параметров experienсе. Дополнительные поведенческие парадигмы, которые позволяют точное время и решению различных моделей зависящей от опыта пластичности или формирования памяти доступны. Эти модели включают страх кондиционирование 23, острый экологической обогащения 24,25, по исследованию объекта роман 26 и визуальный опыт следующую темной воспитания 27. Тем не менее, поведенческая сенсибилизация к кокаину является последовательно надежный поведенческая манипуляции, создавая весьма распространенной след памяти, которая длится в течение нескольких месяцев после кокаина опыт 28.
Мозг подразделяется последующим ручным микродиссекции прилежащем ядре. Это был наш опыт, что руководство микродиссекции от быстро подготовленных срезах мозга обеспечивает самый надежный и быстрый метод извлечения ткани, необходимой для поведенческой парадигмы, и с опытом, границы ткани становится очевидной и легко распознаваться. Кроме того, тонкие ломтики может быть ДГОред, затем лазер-захвата микродиссекции. Хотя этот метод позволяет высоко определяется разграничение интересующей области, это очень медленный процесс (что может привести к потере лабильного мРНК), утомительно и требует дорогостоящего специализированное оборудование (микроскоп, оснащенный лазерной установки захвата). Протокол определено здесь также может быть адаптирована к одноклеточного транскрипции анализа, ручной аспирации цитоплазме визуально выявленных клеток с использованием патч пипетки 29. Важно отметить, что протокол, описанный обеспечивает среднем населения, в то время как весьма вероятно, что в большинстве случаев, только субпопуляции клеток в ткани на самом деле участвует в борьбе с опытом. Представляет интерес к профилю транскрипцию выборочно, изнутри конкретных клеточных популяций, принявших участие в опыте, но обсуждение этих подходов выходит за текущей области.
Для очистки мРНК, с обратной транскрипцией и КПЦР Запросы, тканинарушается, пропуская ее через тонкие иглы, с последующим использованием коммерчески доступных наборов (для получения дополнительной информации, табл 8). Выбор сообщается опытом с этих методологий, обеспечивающих надежную экстракцию высокой РНК качества и надежных результатов последующих применений.
Хотя протокол описан для высокой пропускной кПЦР используя динамические массивы, образцы могут быть проверены экспрессии генов с помощью конечной точки ПЦР, с низкой пропускной КПЦР, генные микрочипы выражения или глубоко секвенирования. Предпочтение высокой пропускной КПЦР с использованием динамических массивов связано с тем, что мРНК, полученной из ядер головного мозга следующие поведенческие парадигмы часто предельных величин. Динамические массивы обеспечить платформу, которая позволяет эффективно всесторонний анализ транскриптов из большого количества параллельных образцов в одном эксперименте. После первоначального приобретения микрожидкостной системы (обычно институциональной о.е.rchase), эксперименты являются относительно недорогими для запуска. После этого анализа, дальнейшее Запрос образцов может быть выполнена с использованием более дорогостоящих платформ для поиска новых транскриптов (на микрочипов или RNAseq) с динамические массивы предоставление всеобъемлющей информации для обеспечения качества. Наконец, для анализа данных, стандартные методы используются. Конкретные указатели, касающиеся вопросов, которые могут возникнуть, будут обсуждены в тексте протокола.
Этот протокол является наиболее подходящим для следователей, заинтересованных в тщательного расследования их системы интересов, обучающихся несколько условий и повторов. Протокол также наиболее подходящий для следователей, которые уже отточенные в (через микрочипов или RNAseq экспериментов) на подмножестве 50-500 интересующих генов, которые они заинтересованы в запросе неоднократно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешное характеристика экспрессии генов из мозговой ткани следующие поведенческие парадигмы зависит от: 1) осторожного обращения мышей во время поведенческой парадигмы; 2) Быстрая и точная рассечение ткани интересов; 3) РНК-сейф меры для обеспечения целостности РНК; и 4) Тщательное пла?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.
Materials
| Virusol | Oriek Medical | J29D | |
| Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
| RNeasy plus Universal Mini Kit | QIAGENE | 73404 | |
| QIAshredder | QIAGENE | 79654 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Invitrogene | AB-4368814 | |
| TE Buffer | Invitrogene | 1355656 | |
| Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm) | Self assembled | ||
| Inner Perspex box (30X30cm) | Self assembled | ||
| camera and video recorder | Campden Inst | CMD-80051 | |
| Media Recorder software | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
| Iris Scissors | FST | FST-14062-09 | |
| Sagital Brain slicer with a 0.5mm section | Brain Tree Scientific | BS-AL-505S | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
| Inverted microspun spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
| Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
| Dynamic array Chip for 96.96gene expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 |
References
- Amit, I., et al. A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling. Nature genetics. 39, 503-512 (2007).
- Citri, A., Yarden, Y. EGF-ERBB signalling: towards the systems level. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Kleim, J. A., Jones, T. A. Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage. Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).
- Kauer, J. A., Malenka, R. C. Synaptic plasticity and addiction. Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).
- Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction. Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).
- Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).
- Koob, G. F., et al. Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence. Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).
- Beurrier, C., Malenka, R. C. Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine. The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).
- Robinson, T. E., Berridge, K. C. The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view. Addiction. 95, S91-S117 (2000).
- Boening, J. A. Neurobiology of an addiction memory. Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).
- Everitt, B. J., Robbins, T. W. Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion. Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).
- Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. The addicted human brain: insights from imaging studies. The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).
- Carlezon, W. A., et al. Regulation of cocaine reward by CREB. Science. 282, 2272-2275 (1998).
- Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).
- Hope, B. T., et al. Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments. Neuron. 13, 1235-1244 (1994).
- Pulipparacharuvil, S., et al. Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity. Neuron. 59, 621-633 (2008).
- Robison, A. J., Nestler, E. J. Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction. Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence. Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).
- Nestler, E. J. The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the. National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).
- Robbins, T. W., Everitt, B. J. Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation. Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).
- Kaplan, G. B., Moore, K. A. The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).
- Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving. Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
- Silingardi, D., et al. ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex. Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84 (2011).
- Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex. The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).
- Steketee, J. D., Kalivas, P. W. Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior. Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).
- Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells. Nature protocols. 7, 118-127 (2012).
