Рак яичников вторжение клеток в мезотелиальной прокладки брюшины представляет собой динамический процесс с течением времени. Используя настоящий анализатор времени, инвазивный потенциал клеток рака яичников в сфероида-мезотелиальной модели со-культуры клеток может быть определена количественно в течение длительных периодов времени, обеспечивая понимание факторов, регулирующих метастатического процесса.
Яичников метастазировать, пролив в перитонеальной жидкости и рассеивания в дистальных сайтов в брюшину. Однослойные культуры не точно смоделировать поведение раковых клеток в пределах неадгезивных окружающей среды, как раковые клетки по своей природе агрегировать в многоклеточных структур, которые способствуют метастатического процесса путем присоединения к и в брюшинную прокладку с образованием вторичных опухолей. Для моделирования этого важного этапа яичников метастазирования рака, многоклеточные агрегаты, или сфероидов, могут быть получены из установленных яичников линий раковых клеток, составленных в соответствии прилипших условиях. Для имитации в брюшную микроокружение которыми сталкиваются опухолевых клеток в живом организме, сфероид-мезотелиальной модель совместное культивирование было установлено, в котором предварительно сфероиды высевают на верхней части мезотелиальной монослоя клеток человека, образованный над внеклеточного матрикса барьера. Методы Затем были разработаны с использованием анализатора в реальном времени клеток для проведения количественного реальноеИзмерения времени из инвазивной способности различных яичников клеток рака линий, выращенных как сфероидах. Такой подход позволяет для непрерывного измерения вторжения в течение длительных периодов времени, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными анализов конечных точек и более трудоемкий реального времени микроскопии изображение анализов. Короче говоря, этот метод позволяет быстро, определение факторов, которые регулируют взаимодействие между раком яичников сфероида клеток вторжения через мезотелиальных и матричных барьеров во времени.
Рак яичников имеет самый высокий уровень смертности всех гинекологических раков 1. Во всем мире насчитывается ~ 230000 случаев и свыше 100000 случаев смерти в результате заболевания каждый 1 год. Большинство пациентов (> 75%) диагностируется после рак уже метастазы, когда лечение осложняется повышенной устойчивостью к химиотерапии и прогноз плохой 2. У больных в стадии III-IV болезни метастатическим есть 5 летняя выживаемость составляет всего 30-40% 3. Таким образом, существует настоятельная потребность в лучшем понимании клеточных поведения, лежащих в основе яичников метастазы рака в целях эффективного лечения поздней стадии заболевания.
Нынешняя модель яичников метастазов рака предлагает несколько шагов в метастатического процесса, каждый из которых происходит в отдельной микросреды, который влияет на поведение опухоли. Метастазирования рака яичников клетки изначально опадает от первичной опухоли и выжить в nonadherЛОР государство в перитонеальной жидкости в виде отдельных клеток или трехмерных многоклеточных структур, называемых многоклеточные агрегаты или сфероидов 2,4,5. Клетки, которые не образуют сфероидов в суспензии, более восприимчивы к anoikis 2,4,5. Сфероиды также проявляют повышенную устойчивость к химиотерапии, способствуя остаточной болезни и последующего рецидива 2,4,5 рака. Второй важный шаг в яичников метастазов рака является переход агрегатов от свободно плавающих кластеров с установленными вторичных опухолей в пределах брюшной стенки и сальника 5,6. Клетка-клетка и клетка-субстрат взаимодействия были вовлечены в образование агрегатов, выживание, и соблюдение внеклеточного матрикса (ECM) производимого мезотелиальной накладки из брюшины 4-11. Пока эти процессы мало изучены.
Для определения механизмов, участвующих в распространении рака яичников, сфероиды может быть сгенерированоованные от установленных линий раковых клеток с использованием неадгезивных культуры методами, поддержания клеток в суспензии либо путем добавления метилцеллюлозы к культуральной среде 12,13 или путем культивирования клеток на низкой крепежных пластин 2,14. При культивировании таким образом, клеток рака яичников собираться в многоклеточных сфероидов или агрегатов, которые демонстрируют сходные клеточные, молекулярные и биохимические свойства в тех опухолевых агрегатов найдено в естественных условиях 2,14. После образования сфероиды могут быть впоследствии собирают из неадгезивных среды и высевали на различных твердых поверхностей для дальнейших функциональных исследований. Это представляет собой шаг вперед по сравнению анализов в монослойной культуре, которая не точно моделировать поведение клеток рака яичников метастазирующих в неадгезивных среде, такой как внутрибрюшинного жидкости.
Инвазивный потенциал сфероидах рака можно оценить в традиционных анализов конечных точек в Бойдена камер 2 </suр>, но этот подход может ввести в заблуждение, так как вторжение яичников раковая клетка представляет собой динамический процесс с течением времени. Недавнее метод в режиме реального времени была разработана с использованием покадровой видео микроскопия мезотелиальной оформления клеток, вторгаясь яичников Spheroids раковые 15,16; Однако анализ данных длительной записи занимает много времени и может быть субъективной. При этом быстрый, количественный метод оценки инвазивных поведения яичников сфероидах рака в реальном времени описывается. Во-первых, модель сотового сфероид-мезотелиальных была создана который представляет собой этап яичников метастазирования рака, когда многоклеточные сфероиды приложить к и вторгнуться в брюшную подкладку с образованием вторичных опухолей. Тогда методика сотового Analyzer в режиме реального времени (RTCA, см. таблицу материалов для деталей компании) был адаптирован для проведения количественных измерений в реальном времени инвазивной способности различных яичников клеток рака линий, выращенных как сфероидах и проверенных в этой модели.
В RTCA вприборной, клеточные ответы контролируются непрерывно в течение анализе, без необходимости экзогенных этикеток, путем измерения изменений в электрическом импедансе. Специально разработанные культуральные планшеты иметь золото с покрытием микроэлектродов, расположенные под микропористой мембраны на границе раздела между верхней и нижней камер 2 на камеры хорошо (CIM '' пластин). Расположение электродов в нижней камере позволяет измерять изменения в электрическом импедансе как клетки проникают через ECM или ECM / сотового барьера. Мембрана интерфейс между 2 камерами каждой пластины скважины CIM будет сначала покрывают ECM компонента, представляющего интерес. В сфероида-мезотелиальных модельной системе клеток, интерфейс покрыта слоем Матригель (см. таблицу материалов для деталей компании), чтобы имитировать сложный ECM, лежащую в основе мезотелиальной слизистую оболочку брюшины, а затем сливной монослоя человека мезотелиальной " целевые "клетки. Наконец, заготовок из яичников Сфероиды рака являются объявлениеДед. Рак яичников сферические клетки должны активно вторгаются через слой клеток-мишеней и матрицы для достижения нижнюю камеру и изменить показания электрического сопротивления. Клетки-мишени сами по себе также оцениваются для того, чтобы они не проникают через матричный слой и пригодны для использования в данном анализе.
Вторжение клеток рака яичников взаимодействовать с различными типами клеток на поверхности брюшины, в том числе фибробласты, адипоциты и мезотелиальных клеток и двунаправленная связь между раковыми клетками и перитонеальных клеток, как полагают, играют ключевую роль в стимулировании метастатического процесса 2. После того, как освоили, протокол, описанный здесь, легко адаптируется к изучению этих взаимодействий в брюшную микросреды, например, путем добавления экзогенных цитокинов, факторов роста, или специфических ингибиторов в верхних или нижних палат пластины CIM скважины или генетических манипуляций рака или перитонеальных клеточных линий. Кроме того, этот метод может быть использован с первичными яичников опухолевых клеток, собранных недавно от злокачественных асцит и / или первичных перитонеального клеток, чтобы получить прямые понимание регуляторных сигналов и клеточных взаимодействий, которые регулируют создание метастатического поражения в брюшной полости <sдо> 2.
Использование прибора RTCA для измерения инвазивного потенциала отдельных клеток или сфероидов имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными одиночными анализов конечных точек и покадровой анализ изображения. Прибор RTCA измеряет сотовой вторжение через определенные промежутки времени непрерывно в течение анализе, который может быть несколько часов или дней. Это позволяет определить изменения в размере вторжения с течением времени, что позволяет преодолеть ограничения отдельных анализов конечных точек. Например, рассматривая данные вторжения из разных линий раковых клеток при одной конечной точки (рис. 2), например, 3 часа, могло бы привести к ошибочному выводу, что КГН и OVCA433 клетки были намного более агрессивны, чем OVCA429 клеток. Еще одно преимущество этой технологии в том, что прибор RTCA измеряет изменения электроимпедансной. Это означает, что анализы могут быть запущены без маркировки клеток с экзогенной агента, который мог иметь непредвиденные последствия для клеток Phenotype или функция. Это становится особенно важным при изучении первичных клеток рака яичников, полученные из злокачественных асцит, с которым крайне важно, чтобы держать манипуляции к минимуму, чтобы избежать введения молекулярных и фенотипические изменения, которые не отражают их природе в естественных 2. Кроме того, использование прибора RTCA позволяет коллекцию количественных данных в реальном времени, которая не только позволяет избежать затрат времени анализы, связанные с покадровой микроскопии, но и дает возможность быстро определить ключевых экспериментальных окон для оптимизации анализа. Это особенно полезно при сравнении эффекты от ряда факторов на сфероида вторжения, так как различные факторы могут оказывать свое максимальные эффекты в различных временных точках или с существенно различными профилями с течением времени.
Хотя этот протокол поддается изменениям (например, использование различных ECM матрицы, различных линий раковых клеток, или иной целевой челLs), если это так, то важно отметить, что различные экспериментальные условия первого должны быть оптимизированы. Например, до начала исследования сфероида вторжения, оптимальное количество раковых клеток / пластину CIM также должен сначала быть определена путем количественного определения числа клеток титрования в монослойной культуре. Оптимальное количество сфероидов, чтобы использовать каждую лунку затем на основе этого анализа. Например, в текущем методе, сфероиды содержать около 3000 клеток каждый, когда первый генерируется. Если начальные числа клеток титрования показывают, что 30 000 клеток в монослое являются оптимальными для обнаружения в вторжения анализирует, то 10 Сфероиды добавляются в CIM пластины хорошо. Кроме того, при проведении совместного культивирования эксперименты, важно изучить поведение в "целевой" клеточный монослой отдельно, чтобы определить эти клетки по своей природе являются ли инвазивными, так как это может смешивать результаты. В примере продемонстрировал, сфероиды раковые высевают на верхней части клетки Monola LP9Ер, с и без FBS добавляются в нижнюю также хемоаттрактанта. Параллельно LP9 клетки культивируют в покое, при каждом условии лечения.
Точно так же, при изучении инвазивной способности клеток и сфероидов, это также важно, чтобы изучить их миграционные способности, а для того, чтобы различать два поведения (то есть вторжение требует протеолитического расщепления в ECM барьер в то время как миграция не делает). Для этого, опустите ECM барьер (Шаги 3.1.1 – 3.1.3) и провести анализ параллельно с ECM барьера в месте. Последний "вторжение" мера может быть исправлена с бывшим «миграции» меры, если это необходимо. Наконец, важно отметить, что информация, полученная от мер электрического импеданса ограничен: как только клетки вторглись в нижней камере, изменения в их прикрепления, распространение и пролиферации на нижней стороне мембраны может способствовать изменениям в сопротивление REAвмятины. Таким образом, эта методика является наиболее информативными при использовании в сочетании с другими анализов сфероида жизнеспособности клеток, адгезии, миграции и морфологии для того, чтобы всесторонне оценить сфероида поведение клеток. Например, в идеальном случае, для того чтобы полностью понять сфероида-мезотелиальной взаимодействий, отдельные со-культуры должны также быть отображены периодически по стандарту фазовой микроскопии так, что качественные оценки морфологии сфероида и здоровья может быть сделано параллельно с количественным RTCA анализов вторжения. Если необязательный шаг маркировка выполняется, то поведение отдельных раковых клеток может быть определена в соответствии с флуоресцентной микроскопии, как они разбивку от сфероида и взаимодействовать с немеченых мезотелиальных клеток. Дополнительным преимуществом флуоресцентно маркировки раковых клеток при совместном культивировании со вторым типом клеток является то, что затем можно утверждать, что только раковые клетки захвачена через клеточные барьеры и ECM.
<p class="jove_content"> Таким образом, этот метод представляет собой высокую пропускную количественный анализ рака яичников сфероида вторжения мезотелиальных и ECM барьеров. Через добавления экзогенных цитокинов, факторов роста, или специфических ингибиторов в верхних или нижних палат CIM пластины а, этот метод позволяет быстро, определение факторов, которые регулируют взаимодействие между раком яичников сфероида клеток вторжения через мезотелиальной и матричных барьеров над Время.The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Фондом науки CASS и медицины Гранта; (МБ); Национальный здравоохранения и Совет по медицинским исследованиям Австралии грантового проекта (КЛС, 338516); и Оперативной программы Инфраструктура поддержки викторианской правительства (Австралия).
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |