Protocol
このプロトコルで説明されているすべての動物の手順は、実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施された、メモリアルスローンケタリングがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUCs）により承認された。
大腿骨から骨髄の1。吸引（BM）細胞
- 精密気化器を用いて投与イソフルラン（1-4％）で大腿骨髄穿刺を受けるマウスを麻酔。麻酔の深さは、外科的処置および/または耳、足指、および尾部ピンチに関連付けられた呼吸数に変化がないことを観察することによって、プロシージャ中のあらゆる5〜10分を監視すべきである。麻酔はイソフルランで誘導し、また、イソフルランによる手順を通して維持されている。 0.05〜0.1ミリグラムの用量でブプレノルフィンの先制事前手続き線量は/ kgを皮下に、すべての6から12時間は、ADJのような手順に関連する痛みを防止するために使用することができますカルプロフェンにUNCT。
- 角膜の乾燥を防ぐために、麻酔の導入後のマウスの眼に眼軟膏を適用します。
- 毛皮を慎重に意図された吸引部位の面積よりも約150％大きく皮膚の領域から切り取られます。緩い毛皮は、湿ったガーゼパッドを用いて除去する。手順の間に低体温症を防ぐために、循環温水パッドまたは他の安全なサーモスタット制御された表面上でマウスを保管してください。
- （ポビドンヨード（ベタジン）またはクロルヘキシジン（Nolvasan）スクラブと70％イソプロピルアルコール、70％エタノールに浸したガーゼスポンジのいずれかと交互に）スクラブが交互に3組の吸引を受ける大腿骨を含む足全体を消毒する。
- BMを吸引する前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄：;：0.5ミリリットルツベルクリンシリンジ（27.5 Gゲージ0.5ccの体積）を濡らす。のPBS 200〜500μlの注射器を記入し、すぐに、PBSを追放。 2〜3トンにこの手順を繰り返しますのIME。
- 薬指や小指のいずれかで脛骨を押すことによって大腿骨から脛骨を曲げておく。適切な麻酔面が達成されたことを確認してください。シリンジを親指と人差し指を使用して保持される。これは、顆を露出させることを可能にし、針の挿入を容易にする。
- 針が大腿骨の2顆の間でセキュアに提出されるように、注射器を湿らせた後、膝蓋腱を通して針を挿入します。親指と人差し指で、大腿骨の骨端に近い骨幹を保持することによって、針は簡単に大腿骨のシャフトに挿入されている。
- それは大腿骨の軸に平行になるように外向き、上向き針を旋回さ。このアクションは、大腿骨シャフトからの骨髄の内容の検索を容易にします。
- 大腿骨髄腔にゆっくりと押しながら、針を時計回りと反時計回りに回します。優しくSYを移動して、針の正確な位置決めを確認横方向にringe。
- BMキャビティ内に前後に針を移動させながら、優しく、負圧にする、後針プランジャーを引く。注：BM吸引量は、一般的に0.4〜0.8×10 6の単核細胞に相当し、約5μLになります。成功吸引は注射器の基部に針の上での血液の出現によって、視覚的に確認される。まだ血液がシリンジ内に見られない場合、それは小さな骨または組織片が針に貼り付けられている可能性がある。これは、（これはシリンジBM吸引する前にPBSで予め充填されるべきである1つの理由で）PBSで上下プランジャを移動させることにより、針から除去することができる。組織がシリンジから外れできない場合は、新しい針と注射器を（再びのPBS 200〜500μlの注射器を濡らし）を使用します。
- BMが正常大腿骨から吸引された後、大腿骨やマウスから針と注射器を取り外します。
- マイクロチューブPRに吸引BMを移動500μlのPBSでefilled。ほとんどのアプリケーションでは、BM細胞を、可能であればさらなる処理まで氷上で保存する。
- 手続きの完了に続いて、5 mg / kgの皮下カルプロフェンと鎮痛剤を投与し。その後、麻酔からマウスを削除し、完全に回復するまで加熱パッドの上に置きます。注記：正しく行われれば吸引手順に従って経験しない合併症や苦痛があってはならない。
- 住宅エリアにマウスを返す前に、彼らが歩き回ると食料や水に到達できることを確認してください。次の24時間での苦痛や感染後の手続きの兆候マウスを観察します。兆候としては、以下が挙げられる：定数出血、貧血、無気力を。これらの徴候のいずれかが後の手順を見ている場合は、動物（S）は、安楽死させなければならない。注：BM吸引/サンプリングを繰り返すことができるが、反復手順は同じ脚に繰り返される外傷を防ぐために反対側の大腿骨に対して行われるべきである。 FRに関する入手可能な情報はほとんどないBM吸引を行うことができるequency。大腿骨髄穿刺は、一般的にこれ以上の頻度で2週間ごとよりも繰り返される。
吸引しBM細胞における細胞含有量の2。評価
- 4 O Cまたは室温で5分間300×gで遠心分離することによりマイクロチューブ内のBM吸引や場所から検索された細胞をペレット化。
- 上清を吸引してから、ACK赤血球細胞溶解バッファー（「塩化アンモニウムカリウム「溶解バッファー）500μl中にペレットを再懸濁します。
- 10分間、赤血球溶解緩衝液中で細胞をインキュベートし、次いで1mlのPBSを添加し、4°Cの 、またはRTで5分間300×gで再び混合物をスピンダウンする。注意：赤血球を溶解ペレットは現在のBM単核細胞で構成されています。これらは、（屠殺したマウスから採取BM細胞が使用されるのと同様に）FACS染色、細胞計数、移植、サイトスピン分析および/または任意の他の使用のために再懸濁させることができる。
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Representative Results
ライブC57/B6マウスの大腿BM吸引犠牲後の同じマウスのBM従来の収穫に続くBM単核細胞を得るために利用された。 2つの方法によって得られたBM単核細胞を、次いで、BM細胞（1）細胞学的分析によって分析し、（2）造血幹/前駆細胞の相対頻度（HSPCs）を決定し、ソートHSPCs（3）ex vivoで培養した。後者の実験では、系統陰性のSca1 + C-KIT +（LSK）細胞は、骨髄吸引によってだけでなく、従来のBMの収穫から得た単核細胞から選別した。各方法で得られた150 LSK細胞を、次いで、技術的連で7日間骨髄赤血球サイトカインを含むメチルセルロース半固体培地に播種した。 図1のAに示すデータは、Bは、バルク細胞およびHSPCs類似のタイプおよび比率は、大腿BM吸引または従来のBMの収穫のいずれかを用いて形態学的およびフローサイトメトリー分析によって見られたことを示している。
定量的に大腿骨髄吸引対従来の骨髄採取で見LSKおよび骨髄前駆細胞の割合を決定するために、我々は3つの独立した願望と、従来の骨髄採取物中の全生細胞の頻度としてLSKとMP亜集団の割合を比較した。 図1Cに表示されたこのデータは、従来の骨髄採取（この差は、任意の集団のために統計的に有意ではなかった）と比較して、大腿骨吸引により採取した骨髄からのLSKとMP亜集団の減少を明らかにする。
メチルセルロース中エクスビボ培養したLSK細胞から選別する（ 図1（d）に示すように）大腿骨髄吸引、従来BM収穫によって得られた類似のコロニー数および細胞型を生じた。観察し、列挙されたコロニーのタイプは、CFU-GEMM（顆粒球、赤血球、単球、megakaryを含めるocyteコロニー形成単位）、CFU-GM（顆粒球、単球コロニー形成単位）、およびBFU-E（赤芽球バースト形成単位）。
マウスを犠牲にすることなく、骨髄内容物の検査を容易にするために、生きたマウスにおける図1の大腿骨髄（BM）吸引。生きたマウスのBM吸引によって得られた単核細胞の（A）ライト·ギムザ染色したサイトスピン。約0.4〜0.8×10 6個の単核細胞は、個々の大腿骨吸引で得ることができる。通常、マウスを犠牲にすることで、従来のBM細胞の単離に対する大腿骨髄吸引（右）によって得られた野生型6週齢のC57/B6マウスの内容は、骨髄しているここに示されている（左）（スケールバーは10μmである。）。（B）の大腿骨髄吸引評価するための細胞の十分な数を提供しています造血幹/前駆細胞コンパートメントのMENTここに示されているように（右：BM吸引液からの細胞を、左：屠殺したマウスからの骨髄の採取により得られた細胞）。 CD34およびFcγRの発現を解析したことで定義されるように、造血幹細胞を含むだけでなく、系列陰性SCA-1-C-KIT +骨髄前駆細胞とそのサブタイプの系統陰性SCA-1 + C-KIT +（LSK）細胞（親ゲートが生きている、系統陰性細胞）。パーセント表示は、ゲート内の細胞の割合を参照してください。LSKの（C）の定量化（細胞、骨髄系前駆（MP）細胞、骨髄系共通前駆細胞（系統陰性SCA-1-C-KIT + CD34 +FcγRの中間+）、顆粒球マクロファージ前駆細胞（系統陰性SCA-1-C-KIT + CD34 +のFcγR+）、および巨核球、赤血球前駆細胞（系統陰性SCA-1-C-KIT + CD34-のFcγR-）、従来の骨髄の収穫からの生細胞の頻度として（N = 3）および大腿骨髄吸引（n = 3）であった。エラーバーは標準脱を表す略称。メチルセルロースコロニーアッセイの（D）の代表的な写真は、メチルセルロースを含む骨髄/赤血球（上記）で1週間に150 LSK細胞のめっき後、その結果、コロニーの数や種類は、各メソッドからのLSK細胞を使用して観察した。観察し、列挙されたコロニーのタイプは、CFU-GEMM（顆粒球、赤血球、単球、巨核球コロニー形成単位）、CFU-GM（顆粒球、単球コロニー形成単位）、およびBFU-E（赤芽球バースト形成単位）が含まれています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
シリアルのBM吸引は、ヒトの血液疾患の臨床研究に不可欠な日常的な手順である。長時間の実験を通して、BMの細胞組成および成分の特徴付けマウスでは、BMの類似シリアルサンプリングを実行する能力は、同様に非常に貴重なものです。この手順では、マウスを犠牲にせずにも、末梢血の内容はBMに存在する細胞が反射性でなくてもよい場合においてBM中の追加の細胞型の存在を検出するためのHSPCの特徴付けのために有用である。シリアルBM吸引は、例えば3免疫不全マウスに異種移植したヒト細胞の存在を監視するこの後者の目的のために非常に効果的に使用されている。 0.4〜0.8×10 6細胞は、通常、各BM吸引を使用して取得していることを考えると、これらの細胞は、細胞学的分析（ 図1A）を含む多くの目的、径のために利用することができるグノーシスフローサイトメトリー（ 図1B）、細胞（ 図1C）の培養を含むソートされた細胞のさらなる下流の使用に続いて、フローサイトメトリーによる細胞分離、核酸抽出、制限された細胞数のプロテオミクス特性評価に向けたアッセイのためのタンパク質抽出、およびさらに移植抽出された細胞の。同時に、それは各々、大腿骨吸引で取り出したHSCの数は、この手順で取得した細胞の全体数によって制限されることに留意することが重要である。例えば、系統陰性のSca1 + CKIT + CD150 + CD48-CD244-細胞などの造血幹細胞の定義を考えると、HSCの周波数は約10 HSCs/100、000セル7である。この周波数に基づいて、約40〜80造血幹細胞は、それぞれの吸引の手順で取得されることが期待されている。 図1Cで述べたように、また、LSK細胞および前駆細胞の頻度は、骨marroに、統計的有意性に達していないものの、低い大腿骨髄穿刺を介して得られた重量の細胞は、従来の骨髄採取と比較した。我々は、手術骨髄採取に吸引相対で見られるこの相対LSKの減少および前駆周波数が大腿骨髄穿刺で発生末梢血による汚染に関連していると信じています。骨髄中の希少細胞集団を評価する上での大腿骨髄吸引のこれらの制限は、留意すべきである。つの追加のノートは、我々は通常、6週齢以上のマウスでは、この手順を実行したことである。我々は、この手順では、6週齢未満のマウスと、ますます技術的に困難であろうと信じています。
この技術は、継続的な競争力のある再構成実験の文脈における末梢血とは対照的に、BMのキメラ化を評価するためによく適している。これらのアッセイでは、マウスの実験セットからHSCのの機能性は、HSC＆一連の既知の数に対してテストされる＃8217; sの読み出しは、末梢血キメラ現象だけでなく、HSCののキメラ現象であることと（Purton らによるレビューを参照8）。摂動が成熟した循環血液細胞へのHSPCの障害分化造血幹細胞区画結果に影響を与える場合、末梢血のキメラ化は、BM中のキメラ化のコントラストもよい。決定的造血移植を9以下の少なくとも16週まで確立されていないことを考えると、そのキメラ現象は、時間10のさらに長い期間の後に変更される場合があり、例えば、ここに示すようにHSPCコンパートメントへの早いアクセスを容易にする技法が特に有用であり得る。 1最近の例では、Challen ら末梢血中のDNMT3A欠損マウスから明らかにした削減キメラ現象が、DNMT3AのHSCキメラにおける逆説的な増加により、DNMT3Aのホモ接合産後欠失したマウス由来のBM細胞の競争力のある移植ヌルHSCのBM 11。自己複製が増加したものの、HSCの- / -この結果は、DNMT3Aの分化不良の指標だった。また、この結果は、すべての16週間の間隔で連続競争力の移植実験に受信者だけ移植したマウスの時限犠牲に見られた。そのため、マウスの犠牲を必要とし、マウスの継続的な観察を許可せず、末梢血と並行して、骨髄細胞の採取を可能にアッセイが非常に有用である。
前述したように、ここで示す手法は、直接マウス2,3の骨髄キャビティ空間内に大腿内注射のために利用される手法と同様である。直接大腿内注射は、静脈内注射6,12,13と直接比較して改良された生着を提供することが示されているマウスにおいてヒト異種移植研究を促進するのに非常に有用であることが証明されている。この技術はあっても許可しています急速にヒトHSCを取り込むのこれまで知られていなかったクラスの識別のためのED。
現在のところは、同じ大腿骨を通してマウスでは、BMの繰り返しのサンプリングは、BMまたは反復願望で取得骨髄細胞の数の細胞組成に影響するかどうかは不明である。さらに、同じ大腿骨から繰り返し吸引手順を実行することが望ましい時間の最小量は知られていない。同じマウスで繰り返さ大腿骨髄願望を行う際には、骨髄吸引に使用される大腿骨を交互にして> 2週間の間隔で連続BM吸引を行う。 BMまたはBMのアーキテクチャから取得した細胞の種類や数に特定の間隔でマウスでの連続大腿骨髄吸引手順の潜在的な影響を、もしあれば、理解することに焦点を当てたさらなる努力が必要である。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
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